巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用的实验研究(2)
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CD68是巨噬细胞特异性标志物，本实验用免疫组化方法检查。免疫组化染色采用SP法(Streptavidin-biotin immunoperoxidase method)，操作步骤按说明书染色步骤进行。
1.6 嵌合体嵌合率的测定
A、B、C组动物接受60Coγ射线全身照射后行豚鼠BMC移植，经环磷酰胺预处理，在21d、35d取外周血检测嵌合率。取A、B、C组大鼠的外周血离心分离得到单个核细胞，用PBS调整细胞浓度至1×106/100μL；取上述细胞悬液100μL，加入小鼠抗豚鼠MHC Class Ⅱ抗体，混匀，避光、室温、孵育15min；加入3mL PBS缓冲液，混匀，1500rpm离心5min，弃除上清，管底留少许液体(≤100μL)；加入1Test PE标记的大鼠抗小鼠IgA二抗，混匀，避光、室温、孵育15min；加入3mL PBS缓冲液，混匀，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.5～1mL PBS重悬，6h内上流式细胞仪检测，通过细胞阳性率来检测受体大鼠的外周血中豚鼠细胞比例。
1.7 外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞检测
正常大鼠及实验组BMC移植后21d流式细胞仪检测外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的水平。取受体大鼠外周血100μL，加入带标记的CD3、CD4、CD8抗体，混匀，避光、室温、孵育15～20min后加入A液、B液和C液进行红细胞裂解；加入5倍以上体积PBS缓冲液，混匀，1500rpm离心5min，弃除上清，管底留少许液体(≤100μL)；加入0.5～1mL PBS重悬，流式细胞仪检测。
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