人不同转移潜能前列腺癌细胞系的放射敏感性异质性及其机理观察(2)
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参见附件。
1.4 荧光染色观察细胞凋亡
将对数生长期PC-3M-2B4和PC-3M-IE8细胞，于6 Gy照射后0.5、24、48 h后收集细胞，用PBS重悬，调整细胞数为1×107/ml，PBS洗一次，加入荧光染料Hoechst 33258及PI，37 ℃避光30 min，取1滴细胞悬液滴于载波片上，盖上盖玻片，紫外光激发，荧光显微镜下，滤光片515 nm观察、拍照，每次实验的每一组计数200个细胞，计算3次实验的平均数。
1.5 细胞凋亡的电镜观察
将对数生长期PC-3M-2B4和PC-3M-IE8细胞，于6 Gy照射后0.5、24、48 h后收集细胞，用PBS洗三遍，制作电镜样品[2]。
1.6 Western-blot测定Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的差异
将对数生长期PC-3M-2B4和PC-3M-IE8细胞，于6 Gy照射后0.5、12、24、48 h后收集细胞，加入裂解缓冲液，充分裂解后以12 000 r/min离心5 min，取上清，用lowry’s法测定总蛋白浓度，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗体，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜后加入抗兔HRP抗体，室温摇床2 h，洗膜后ECL发光，在暗室中显影，冲洗胶片后扫描至计算机，用Image-J图像分析软件对结果进行半定量分析，计算各目标条带的灰度值和面积，以两者的乘积与内参GAPDH的比值作为目标蛋白相对表达量。
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