子痫前期患者胎盘HIF—1α和IL—6表达差异对胎儿发育的影响分析(2)
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1.2.3 Western blotting 法测定各组胎盘组织中 HIF-1α和IL-6 蛋白的表达(1)提取总蛋白：取剩下的1/4待测胎盘组织，150 mg/例。置入匀浆器中，依次加入2 ml RIPA裂解液和20 ul PMSF蛋白抑制酶，充分裂解后吸取至EP管中。将EP管置于4 ℃下以14 000 r/min离心10 min，吸取上清液进行分装。按3∶1的比例加入蛋白样品并充分混匀。置于沸水中煮沸约5 min，然后
14 000 r/min离心10 min，最后放入-80 ℃冰箱保存。(2)SDS-PAGE电泳：先配制10%SDS-PAGE 分离胶(6 ml)及配制5%SDS-PAGE浓缩胶(4 ml)，充分混匀后迅速将分离胶灌至玻璃夹板的绿线处，加入超纯水封胶。灌入浓缩胶后置于37 ℃恒温箱放置15 min。
将玻璃胶板放入电泳槽后加入电泳缓冲液，在恒压60 V下预电泳15 min。将目的蛋白样品放入沸水中煮5 min后14 000 r/min离心10 min，在加样孔中加入Marker 以及样品。再将电压调至80 V，待Marker出现后，即将电压加至 110 V，待溴酚蓝跑到分离胶的底端即可停止电泳。根据Marker的位置切胶，然后行常规转膜及封闭。(3)抗体反应及显色结果：将兔抗人HIF-1α多克隆抗体(稀释度为1∶250)、鼠抗人IL-6单克隆抗体(稀释度为1∶100)，和肌动蛋白β-actin鼠单克隆抗体(稀释度为1∶1000)稀释成抗体溶液(均为美国Santa Cruz公司)，滴加抗体溶液4～6滴于膜蛋白后置于37 ℃恒温15 min ......
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