氟骨症的分子机制研究进展(2)
3氟骨症的其他分子机制
为了获得更多的氟中毒细胞变化的信息来研究中毒机制，国内外学者采用基因芯片、蛋白质芯片等方法对氟中毒的机制进行了高通量的研究。发现了一些特异的现象。
缪庆等[7]首次采用mRNA差异显示聚合酶链反应技术，对大鼠染氟(氟化钠2.0 mmol/L)2周的成骨细胞与正常成骨细胞之间基因的差异表达进行比较分析。在已克隆到的6个差异表达的基因片段中，大鼠核糖体蛋白L5基因、大鼠Na+,K+-ATP酶β3基因、大鼠细胞核定位信号蛋白质受体α2基因和大鼠高尔基体p28基因在染氟成骨细胞中低表达，小鼠遍在蛋白缀合酶基因及1个新基因片段在染氟成骨细胞中表达上调。这些基因多与蛋白质的合成、转运及加工有关。
Borderie[8]用能产生NO的供体处理骨关节炎患者的滑膜成纤维细胞6 h后，就有凋亡细胞的出现，而胞质中的P53蛋白表达显著增加，说明NO诱导的凋亡在骨关节炎发病过程中起着关键性的作用，P53蛋白可能起一种保护性的作用。自由基持续存在，巨线粒体的膜电位降低引起凋亡诱导因子释放入胞质中，细胞色素C和凋亡诱导因子可引起细胞的凋亡变化。另有研究显示，H2O2和超氧阴离子O2-引起的细胞凋亡与P53蛋白增加有关，或是H2O2诱导Bax和Bad从细胞质移位至线粒体，与Bcl-2形成异二聚体，随之细胞色素C释放，CPP32活化，ADP核糖聚合酶裂解，引起细胞凋亡。NO在诱导软骨细胞凋亡、促进骨关节病发生的生物学机制中具有重要作用。但NO诱发软骨细胞凋亡的具体机制目前还不十分清楚。有学者认为NO通过激活线粒体细胞色素C的途径来激活Caspase-3，从而诱导细胞凋亡。NO能激活抗凋亡蛋白Bax，Bax能引起线粒体释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)结合，激活启动型Caspase(Caspase-9)，再激活执行型Caspase(Caspase-3)，Caspase-3剪切蛋白后，此蛋白质酶体蛋白(一种核酸内切酶)进入细胞核内，开始降解DNA链，导致细胞凋亡。
, 百拇医药
邵红等[9,10]利用基因芯片技术检测了氟中毒患者外周血中mRNA的表达情况，结果表明，与健康对照组比较，轻度组有32个基因表达上调，有32个基因表达下调；重度组有53个基因表达上调，有20个基因表达下调；重度组与轻度组比较仅有4个基因表达上调，11个基因表达下调；轻度氟中毒组和重度氟中毒组分别与对照组比较，有2个基因表达同时出现显著上调，分别为RAS基因和跨膜蛋白9家族1基因；有14个基因表达同时出现显著下调，如：转录因子P38蛋白、乳运铁蛋白、角蛋白4、腺苷受体A2b、ATP合酶等。其中包括与蛋白质合成有关的3个基因：线粒体翻译起始因子2(MTIF2)、单链DNA结合蛋白(PURA)和细胞毒颗粒相关蛋白(TIA1)。
徐辉等[11]采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养。抽提成骨细胞蛋白后，用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行分析鉴定。结果表明，在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种蛋白(7种表达增多，5种降低，其中1种表达下降的蛋白被鉴定为未知蛋白)，主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白，主要有以下几类：(1)与细胞功能活跃、代谢旺盛相关的蛋白。如催化ATP生成的ATP合酶表达增加；核苷二磷酸激酶(NDPK)和蛋白酶体26S ATP酶表达下降。细胞内天冬氨酸氨基转移酶(GOT)的表达上调，也应属于代谢活跃的表现。(2)与细胞增殖信号相关的蛋白，如二氢嘧啶酶样蛋白(DHPL2)。染氟成骨细胞增殖活跃的同时DHPL2表达增多。提示这种酶也可能参与促成骨细胞分化、成熟的调节。另一种表达上调的蛋白为Ras-GTP酶激活蛋白，它与相对分子质量小的G蛋白密切相关。(3)一些分子伴侣蛋白和相关的酶。包括热休克蛋白、蛋白二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白的表达上调。(4)与膜结构和细胞骨架相关的蛋白，如微管蛋白和磷脂酰乙醇胺结合蛋白的表达下降。从上面对各种组织在氟作用后进行的差异蛋白或基因显示结果分析发现，Ras基因在氟中毒人外周血及小鼠成骨细胞中均上调，而且在人外周血中P38下调，两者均是MAPK信号通路中的关键点。
, 百拇医药
综上所述，不难看出目前有关氟骨症的相关研究已步入较深入的研讨之中。关于氟骨症的分子机制研究已做了大量工作，在相应的信号通路方面研究也累积了大量的资料，然而将目前较热门的各条可能起作用的信号通路联系起来，构成合乎逻辑的体系，将成为更加重要的发展途径。
参考文献
[1]McDonagh MS，Whiting PF，Wilson PM，et al.Systematic review of water fluoridation.BMJ,2000,321(7265)：855-859.
[2]Qu WJ,Zhong DB,Wu PF,et al.Sodium fluoride modulates eaprine osteoblast proliferation and diferentiation.J Bone Miner Metab,2008，26(4)：328-334.
, http://www.100md.com
[3]Wu LW,Yoon YK,Baylink DJ,et al.Fluoride at mitogenie doses induces a sustained activation of P44 mapk，but not P42 mapk，in Human TE85 osteosarcoma cells.J Clin Endoerinol Metab,1997,82(4):1126-1135.
[4]Lau KH,Baylink DJ.Molecularmechanism of action of fluoride on bone cells.JboneMinerRes,1998,13(11):1660-1667.
[5]Caverzasio J,Palmer G,Suzuki A,et al.Mechanism of the mitogenic efect of fluoride on osteoblast-like cells:evidences for a G protein-dependenttyrosine phosphorylation process.JBone Miner Res,1997,12(12):1975-1983.
, 百拇医药
[6]孙元明,杨福军,李雨民,等.细胞凋亡信息分子Fas、FasL和NF-KB在氟化物作用后破骨样细胞凋亡过程中的表达.中国医学科学院学报,2002,24(5):491-494.
[7]缪庆,刘秉慈,张绪超,等.染氟成骨细胞差异表达基因的cDNA克隆.中华预防医学杂志,2003,37(4):251-255.
[8]Borderie D，Hilliquin P，Hernvann A，et al.Apoptosis induced by nitric oxide is associated with nuclear Pss protein expression in cuhured osteoarthritic synoviocytes.Osteoar-thritis.Cartilage，1999，7:203-213.
[9]邵红,刘开泰,姚华,等.氟中毒患者外周血淋巴细胞基因表达水平的研究.地方病通报,2005,20(2):1-4.
[10]邵红,刘开泰,姚华,等.氟中毒相关基因对患者蛋白质合成的影响.微量元素与健康研究，2005，22(4)：1-4.
[11]徐辉,井铃,张承巍,等.染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定.中国地方病学杂志,2006,25(1):35-38., 百拇医药(牟蔚平 颜虹 张联合)
为了获得更多的氟中毒细胞变化的信息来研究中毒机制，国内外学者采用基因芯片、蛋白质芯片等方法对氟中毒的机制进行了高通量的研究。发现了一些特异的现象。
缪庆等[7]首次采用mRNA差异显示聚合酶链反应技术，对大鼠染氟(氟化钠2.0 mmol/L)2周的成骨细胞与正常成骨细胞之间基因的差异表达进行比较分析。在已克隆到的6个差异表达的基因片段中，大鼠核糖体蛋白L5基因、大鼠Na+,K+-ATP酶β3基因、大鼠细胞核定位信号蛋白质受体α2基因和大鼠高尔基体p28基因在染氟成骨细胞中低表达，小鼠遍在蛋白缀合酶基因及1个新基因片段在染氟成骨细胞中表达上调。这些基因多与蛋白质的合成、转运及加工有关。
Borderie[8]用能产生NO的供体处理骨关节炎患者的滑膜成纤维细胞6 h后，就有凋亡细胞的出现，而胞质中的P53蛋白表达显著增加，说明NO诱导的凋亡在骨关节炎发病过程中起着关键性的作用，P53蛋白可能起一种保护性的作用。自由基持续存在，巨线粒体的膜电位降低引起凋亡诱导因子释放入胞质中，细胞色素C和凋亡诱导因子可引起细胞的凋亡变化。另有研究显示，H2O2和超氧阴离子O2-引起的细胞凋亡与P53蛋白增加有关，或是H2O2诱导Bax和Bad从细胞质移位至线粒体，与Bcl-2形成异二聚体，随之细胞色素C释放，CPP32活化，ADP核糖聚合酶裂解，引起细胞凋亡。NO在诱导软骨细胞凋亡、促进骨关节病发生的生物学机制中具有重要作用。但NO诱发软骨细胞凋亡的具体机制目前还不十分清楚。有学者认为NO通过激活线粒体细胞色素C的途径来激活Caspase-3，从而诱导细胞凋亡。NO能激活抗凋亡蛋白Bax，Bax能引起线粒体释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)结合，激活启动型Caspase(Caspase-9)，再激活执行型Caspase(Caspase-3)，Caspase-3剪切蛋白后，此蛋白质酶体蛋白(一种核酸内切酶)进入细胞核内，开始降解DNA链，导致细胞凋亡。
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邵红等[9,10]利用基因芯片技术检测了氟中毒患者外周血中mRNA的表达情况，结果表明，与健康对照组比较，轻度组有32个基因表达上调，有32个基因表达下调；重度组有53个基因表达上调，有20个基因表达下调；重度组与轻度组比较仅有4个基因表达上调，11个基因表达下调；轻度氟中毒组和重度氟中毒组分别与对照组比较，有2个基因表达同时出现显著上调，分别为RAS基因和跨膜蛋白9家族1基因；有14个基因表达同时出现显著下调，如：转录因子P38蛋白、乳运铁蛋白、角蛋白4、腺苷受体A2b、ATP合酶等。其中包括与蛋白质合成有关的3个基因：线粒体翻译起始因子2(MTIF2)、单链DNA结合蛋白(PURA)和细胞毒颗粒相关蛋白(TIA1)。
徐辉等[11]采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养。抽提成骨细胞蛋白后，用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行分析鉴定。结果表明，在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种蛋白(7种表达增多，5种降低，其中1种表达下降的蛋白被鉴定为未知蛋白)，主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白，主要有以下几类：(1)与细胞功能活跃、代谢旺盛相关的蛋白。如催化ATP生成的ATP合酶表达增加；核苷二磷酸激酶(NDPK)和蛋白酶体26S ATP酶表达下降。细胞内天冬氨酸氨基转移酶(GOT)的表达上调，也应属于代谢活跃的表现。(2)与细胞增殖信号相关的蛋白，如二氢嘧啶酶样蛋白(DHPL2)。染氟成骨细胞增殖活跃的同时DHPL2表达增多。提示这种酶也可能参与促成骨细胞分化、成熟的调节。另一种表达上调的蛋白为Ras-GTP酶激活蛋白，它与相对分子质量小的G蛋白密切相关。(3)一些分子伴侣蛋白和相关的酶。包括热休克蛋白、蛋白二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白的表达上调。(4)与膜结构和细胞骨架相关的蛋白，如微管蛋白和磷脂酰乙醇胺结合蛋白的表达下降。从上面对各种组织在氟作用后进行的差异蛋白或基因显示结果分析发现，Ras基因在氟中毒人外周血及小鼠成骨细胞中均上调，而且在人外周血中P38下调，两者均是MAPK信号通路中的关键点。
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综上所述，不难看出目前有关氟骨症的相关研究已步入较深入的研讨之中。关于氟骨症的分子机制研究已做了大量工作，在相应的信号通路方面研究也累积了大量的资料，然而将目前较热门的各条可能起作用的信号通路联系起来，构成合乎逻辑的体系，将成为更加重要的发展途径。
参考文献
[1]McDonagh MS，Whiting PF，Wilson PM，et al.Systematic review of water fluoridation.BMJ,2000,321(7265)：855-859.
[2]Qu WJ,Zhong DB,Wu PF,et al.Sodium fluoride modulates eaprine osteoblast proliferation and diferentiation.J Bone Miner Metab,2008，26(4)：328-334.
, http://www.100md.com
[3]Wu LW,Yoon YK,Baylink DJ,et al.Fluoride at mitogenie doses induces a sustained activation of P44 mapk，but not P42 mapk，in Human TE85 osteosarcoma cells.J Clin Endoerinol Metab,1997,82(4):1126-1135.
[4]Lau KH,Baylink DJ.Molecularmechanism of action of fluoride on bone cells.JboneMinerRes,1998,13(11):1660-1667.
[5]Caverzasio J,Palmer G,Suzuki A,et al.Mechanism of the mitogenic efect of fluoride on osteoblast-like cells:evidences for a G protein-dependenttyrosine phosphorylation process.JBone Miner Res,1997,12(12):1975-1983.
, 百拇医药
[6]孙元明,杨福军,李雨民,等.细胞凋亡信息分子Fas、FasL和NF-KB在氟化物作用后破骨样细胞凋亡过程中的表达.中国医学科学院学报,2002,24(5):491-494.
[7]缪庆,刘秉慈,张绪超,等.染氟成骨细胞差异表达基因的cDNA克隆.中华预防医学杂志,2003,37(4):251-255.
[8]Borderie D，Hilliquin P，Hernvann A，et al.Apoptosis induced by nitric oxide is associated with nuclear Pss protein expression in cuhured osteoarthritic synoviocytes.Osteoar-thritis.Cartilage，1999，7:203-213.
[9]邵红,刘开泰,姚华,等.氟中毒患者外周血淋巴细胞基因表达水平的研究.地方病通报,2005,20(2):1-4.
[10]邵红,刘开泰,姚华,等.氟中毒相关基因对患者蛋白质合成的影响.微量元素与健康研究，2005，22(4)：1-4.
[11]徐辉,井铃,张承巍,等.染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定.中国地方病学杂志,2006,25(1):35-38., 百拇医药(牟蔚平 颜虹 张联合)