神经节苷脂对大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3表达的影响(2)
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参见附件。
1.3 仪器 OLYMPUS BX51F32HO1型光学显微镜(日本电子);LKB-NOVA型超薄切片机(瑞典LKB)。
1.4 动物分组、模型建立及给药方法 Wistar大鼠42只随机分为神经节苷脂GM1治疗组、脑缺血再灌注损伤模型组、正常对照组(以下相应称为GM1组、模型组、正常组),14只/组。每组又随机分为再灌注1、24 h 两个时间点,每个时间点7只。采用右侧大脑中动脉线栓法,参照Zea-Longa法[3]并改良,造成大脑局部缺血30 min模型。GM1组于缺血即刻腹腔注射GM 130 mg/kg。模型组和正常组大鼠腹腔注射相同剂量生理盐水。
1.5 神经病学评分 参考Longa等[3]评分法:0分:无神经功能缺失症状,活动正常者;1分:不能伸展对侧前爪者;2分:爬行时出现向左转圈者;3 分:行走时身体向偏瘫侧倾倒者;4分:不能自发行走,意识丧失者;5分:死亡。清醒后评分为0分和5分者均被剔除,随机补充。
1.6 取材 各组大鼠分别于再灌注后1、24 h取材,每个时间段组取7只。水合氯醛过量麻醉后,常规经心脏灌注、固定,取脑置于10% 中性甲醛中固定,去除小脑及脑干,做冠状切片,共5个脑片,取第三脑片,依次脱水、透明、浸蜡、包埋,切取5 μm厚组织切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察脑组织变化。
1.7 Caspase-3免疫阳性细胞的检测 采用二步法检测,步骤严格按说明书进行。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。Caspase-3阳性细胞呈棕黄色或黄褐色,显微镜下选取每个区域不重复随机10个高倍视野(×400),计数Caspase-3阳性细胞数,求平均值。
1.8 统计学方法 实验结果以(x±s)表示。用SPSS11.5软件分析,多组间比较用单因素方差分析检验,同一时间点两组间比较用Dunnett-t检验,不同时间点的比较用两样本t检验。 P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 神经病学评分比较 正常组均为0分;再灌注1 h及24 h模型组神经功能评分为(2.57±0.53),(2.29±0.49);GM1治疗组为(1.14±0.38),(1.00±0.58),明显低于模型组(P<0.01)。见表1。
2.2 光镜下病理形态学观察 正常组大鼠的脑组织,未见异常改变;模型组再灌注1 h已有中心坏死区形成,可见神经细胞消失,部分神经元皱缩,呈三角形,核浆分界不清,神经细胞水肿,还有少量形态完全的可逆性受损细胞,病灶周围以可逆性受损细胞及正常细胞为主;模型组再灌注24 h病灶中心区神经细胞脱失更明显,范围较1 h明显增大,神经元胞体肿胀、核固缩、核碎裂及溶解,胞浆染色变淡,梗死血管周围出现大片空泡区,提示严重脑水肿 ......
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