十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长机理的实验研究(2)
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1.6 观察指标与方法
1.6.1 血样分析 三组动物按三个时间段进行P-ALP、S-Ca、S-P分析,将兔放兔盒中固定,选耳后静脉清晰部位拔除局部绒毛,75%乙醇消毒,摩擦静脉使之扩张,用6号针头在耳缘静脉末稍刺破血管,待血渗出后用注射器抽取血液2 ml放不加抗凝剂试管中,用80-Z离心机离心制成血清,用奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪分析血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)。
1.6.2 骨痂分析 羟脯氨酸(HRP)、钙(Ca)、磷(P)。将新鲜骨痂用丙酮脱脂脱水12 h真空干燥称重,用10%三氯乙酸脱钙脱磷,用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙;用孔雀绿直接显色法测提取液中的磷,剩余骨痂用蒸馏水冲洗,滤纸吸去多余的水分称重,用样本碱水解法测骨痂中的羟脯氨酸。具体做法:①骨痂标本丙酮脱脂脱水,用TH2-88-1型多用恒温台式振荡器振荡3 h后,静置12 h,使脱水完全取出样本置于真空干燥皿中,用SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵真空干燥后,用MettierH54AR十万分之一分析电子天平称重,将干燥样本浸在3 ml,10%三氯乙酸中提取样本中的钙、磷24 h取出样本待用。按试剂盒说明方法测钙、磷;②用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙(Ca)含量,空白管、标准管,测定管中各加1.0 ml甲基百香酚蓝(MTB)试剂和2.0 ml碱性溶液,空白管加20 μl去离子水,标准管加20 μ、25 mmol/L钙标准液测定管中加20 μl待测提取液,分别混匀静置5 min后,波长610 nm、1 cm光径,蒸馏水调零,HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;③用孔雀绿直接显色法测提取液中磷含量,空白管标准管测定管分别加入1 ml尿素溶液2 ml孔雀绿-钼酸液,再空白管中加20 μl去离子水,标准管加20 μl、1.29 mmol/L磷标准应用液,测定管加20 μl待测提取液,分别混匀,室温准确放15 min,640 nm、1 cm光径,蒸馏水调零用HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;④从10%三氯乙酸中取出骨痂样本经蒸馏水冲洗后滤纸吸取多余水份,用电子天平称重(取样本湿重)用样本水解法测羟脯氨酸(HRP)含量 ......
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