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编号:11529308
超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量
http://www.100md.com 2008年2月24日 《中国实用医药》 2007年第32期
超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量
超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量
超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量

     【摘 要】 目的 建立同时测定大豆异黄酮胶囊中6种异黄酮含量的超高效液相色谱法(HPLC)。方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×50 mm),流动相为甲醇-0.05 mol/L乙酸胺(pH4.6),梯度洗脱,检测波长为260 nm,流速为0.4 ml/min,柱温为40℃,外标法测定。结果 大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在0.026 00~0.260 0 mg/ml、0.026 25~0.262 5 mg/ml、0.026 75~0.267 5 mg/ml、0.012 650~0.126 50 mg/ml、0.012 525~0.125 25 mg/ml、0.012 750~0.127 50 mg/ml范围内线性关系良好(r≥0.993 0),加样回收率(6例)分别为:98.5%、98.8%、98.2%、97.7%、98.0%、97.3%。结论 本法快速、简便、准确、灵敏度高、成本低,适用于大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量测定及质量控制。

    【关键词】 大豆异黄酮胶囊;异黄酮;超高效液相色谱法;含量测定

    大豆异黄酮是大豆生长中形成的一种次生代谢产物,是生物黄酮的一种,也是天然的植物雌激素,具有抗衰老、抗肿瘤、防治骨质疏松、预防心脑血管疾病,以及抗高血压、降血脂等功效。大豆异黄酮胶囊性质稳定,安全有效,在临床上和保健品领域上得到广泛应用[1-2]。 大豆异黄酮又名类黄酮,目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种,其主要成分有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素。采用传统HPLC法测定时,检验周期长,低含量组分的检出效果不理想[3]。UPLC 的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC 的9、3及1.7倍[4],本文采用超高效液相色谱法同时测定大豆异黄酮中6种有效成分的含量,快速、准确且成本低廉。

    1 仪器与试药

    Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪,紫外检测器,Empower 2色谱工作站。

    大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素对照品由中国药品生物制品检定所提供,含量测定用大豆异黄酮胶囊(20060501、20060502、20060503)由广东康雅生物制药公司提供。甲醇为色谱纯,实验用水为超纯水。

    2 实验方法

    2.1 色谱条件 Acquity UPLCTM BEH C-18柱,1.7 μm,2.1 mm×50 mm,甲醇-0.05 mol/L乙酸胺(pH4.6)为流动相,梯度洗脱,洗脱条件见表1;检测波长为260 nm;流速为1.0 ml/min;柱温为40℃;进样量为2 μl。对照品液、样品液及阴性对照液的色谱图如图1所示。

    0.05 mol/L乙酸胺溶液(pH=4.6)∶准确称取3.85 g乙酸铵于烧杯中,用适量水溶解转移至1 000 ml容量瓶中,加水500 ml,加入3.00 ml冰醋酸,摇匀,加水至刻度,摇匀。

    2.2 溶液制备

    2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷干燥至恒重的大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)和染料木素(Genistein)对照品,加甲醇制成每1 ml分别含0.10、0.10、0.10 、0.05、0.05、0.05 mg的溶液,作为对照品溶液,用0.22 μm的微孔滤膜过滤,即得。

    3 实验结果

    3.1 线性关系 分别称取对照品适量,精密称定,用甲醇制成每1 ml中含大豆苷1 mg、黄豆黄苷1 mg、染料木苷1 mg、大豆苷元0.5 mg、黄豆黄素0.5 mg、染料木素0.5 mg的混合溶液,摇匀,作为储备液。分别精密量取储备液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml置于10 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度。按上述色谱条件下平行测定3 次,以峰面积的平均值Y对浓度X(mg/ml)进行线性回归。计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的回归方程

    3.2 重复性试验 取大豆异黄酮胶囊(20060501),按“2.2.2”项下方法平行制备5份样品溶液,分别测定其含量,大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量测定结果的RSD分别为0.8%、0.9%、0.5%、1.0%、1.3%、1.6%。

    3.4 检测限和定量限 将对照品溶液逐步稀释后进样,以信噪比为3 计,大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的最低检测限浓度分别为5.2、4.8、6.5、3.8、4.2、4.6 ng,以信噪比为10 计,大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的定量限浓度分别为38.5、32.3、40.8、28.4、34.0、38.8 ng。

    3.5 加样回收率 取己知含量的大豆异黄酮胶囊内容物9份各125 mg,精密称定,分别精密加入“2.2.1”项下的混合对照品溶液8、8、8、10、10、10、12、12、12 ml,按“2.2.2”项下方法处理后,含量测定项色谱条件下测定,大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均回收率分别为98.5%、98.8%、98.2%、97.7%、98.0%、97.4%,RSD分别为0.8%、0.5%、1.1%、1.0%、0.8%、0.6%。

    3.6 含量测定 取3批样品,按“2.2.2”项下方法处理,上述色谱条件下,精密量取样品溶液0.2 μl注入液相色谱仪中,按外标法定量,测定结果 见表2。

    4 讨论

    4.1 波长选择 取大豆异黄酮对照品混合溶液在190~400 nm内进行紫外扫描(见图2),结果发现,在260 nm处有最大吸收峰,且总峰面积最大,由此确定紫外检测器的检测波长为260 nm。

    4.2 柱温选择 柱温影响大豆异黄酮有效成分的保留时间及分离度,柱温过高,分离度不好,影响色谱柱寿命;柱温过低,分析时间延长,灵敏度降低[5]。通过试验,本方法确定柱温为40℃。

    参考文献

    1 江和源,吕飞杰,邰建祥,等.高效液相测定大豆中异黄酮的含量.食品科学,2000,21(4):56-58.

    2 张蓓.大豆异黄酮的生物活性及保健功效.职业与健康,2006,22(3):176-178.

    3 王春蛾,刘叔义.大豆异黄酮的成份、含量及特性.食品科学,2000,19(4):23-30.

    4 吴小刚,吴周和,吴传茂,等.高效液相色谱法测定大豆制品中异黄酮的含量.中国酿制,2006(7):65-67.

    5 孙梅君,骆炼,史长颖,等.中国大豆制品中异黄酮含量测定和分析研究.食品与发酵工业,1999,26(5):14-18., 百拇医药(吴昭怡 王洁梅 吴爱琴)