脂肪干细胞成脂分化的研究进展(1)
[摘要]创伤或肿瘤导致的软组织缺损是整形科的常见问题，现有的组织瓣移植、人工材料充填或脂肪移植等方法均有一定局限性。脂肪干细胞(adipose-derived stem eells，ASCs)是来自脂肪组织的具有多向分化潜能的干细胞，基于ASCs的干细胞治疗，或利用其成脂分化能力构建组织工程脂肪，为软组织缺损的修复重建提供了新的思路，在整形美容和再生医学中展示了良好的前景。体外利用药物和化学试剂诱导ASCs成脂分化的方法已经非常成熟。支架材料通过模拟干细胞的体内微环境，可促进ASCs的黏附、增殖和成脂分化，其中脱细胞脂肪组织支架是目前脂肪组织工程支架材料的研究热点。研究显示ASCs的供体种属、性别、年龄、脂肪获取部位和方法等供体因素，细胞亚群、ASCs代数、培养液、冻存等实验因素，表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、骨形成蛋白、尼尔样1型分子等生长因子，胰岛素、糖皮质激素、雌激素、生长激素、瘦素、催产素和卡贝缩宫素等激素，异丁基甲基黄嘌呤、紫杉醇、胰高血糖素样肽等化学药物，放射线和激光等物理因素，以及To11样受体、富血小板血浆和富血小板纤维蛋白、人腺病毒36亚型、核心结合因子α1等其他因素均可影响ASCs的成脂分化。因此综合利用各种上述因素，促进ASCs的增殖和定向分化，在整形美容和再生医学等领域具有重要的意义和应用前景。本文总结了诱导和验证ASCs成脂分化的方法，讨论了主要影响因素及其机制，介绍了解放军总医院整形修复科和美国MD安德森肿瘤中心整形科组织再生和分子细胞工程实验室(Tis sue Regeneration andMolecular Cell Engineering Lab，TRAMCEL)的相关经验，展望了未来研究方向。
[关键词]脂肪干细胞；分化；成脂分化；影响因素；机制
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455(2016)04-0086-08
创伤和肿瘤导致的软组织缺损是整形修复科的常见问题，严重影响患者的外形和功能。以乳腺癌术后的乳房缺损为例，在解放军总医院整形修复科约占患者量的7%，而在美国MD安德森肿瘤中心(MD Anderson Cancer Center，MDACC)整形科占患者量高达55%。常规的治疗方法是组织瓣移植、人工材料充填或脂肪移植等，但均有一定局限性。腹部肌皮瓣游离移植是重建乳房的重要手段，尽管移植后坏死等并发症的发生率越来越低，但是不可避免供区损伤。随着材料工业的发展，硅胶假体植入逐渐成为了隆胸和乳房重建的重要手段，其动态外形和手感越来越接近真实组织，但是仍存在异物反应和纤维囊包膜挛缩的风险。更重要的是，截止至2015年11月，MDACC整形科共发现了87例由于乳房假体植入导致的问变性大细胞淋巴瘤，其中位存活期为13年，5年存活率89%。尽管其发病率非常低，约百万分之一至三，且通过外科切除可有效治疗，但仍然为乳房假体植入的患者增添了一丝隐患。应用自体脂肪移植充填软组织凹陷是整形美容外科的常用方法，但是用于重建乳房等较大缺损时易因缺血而吸收，吸收率高且无法预测，常需要二次手术。
组织工程和再生医学为修复或替换受损组织提供了新的途径，而种子细胞是其中的关键。脂肪干细胞(adipose derived stem cell，ASCs)的来源充足、获取简便、产量高、增殖快，具有多向分化潜能，可旁分泌各种细胞因子，促进血管形成，发挥免疫调节作用，并能招募其他细胞参与重建，因此一直是种子细胞的热门人选。Zuk等最早验证了ASCs具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞分化的多向分化潜能。除了上述细胞外，研究证实ASCs在特定的诱导条件下可向平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肌腱细胞、神经细胞、胰岛细胞、表皮细胞、内皮细胞、内耳毛细胞、角膜细胞、造血细胞和肝细胞样细胞等内、中、外三胚层的多种细胞分化(图1)。基于ASCs的干细胞疗法，或利用ASCs的成脂分化能力构建组织工程脂肪，逐渐成为再生医学的研究热点，但是目前缺乏对于ASCs成脂分化的系统综述。本文总结了诱导和验证ASCs成脂分化的方法，讨论了主要影响因素及其机制，介绍了解放军总医院整形修复科和MDACC整形科组织再生和分子细胞工程实验室的相关经验，并展望了未来研究方向。
1数据来源
于2016年2月20日在PubMed中以“(((adipose stem cell[Title])OR adipose derived stem cell[Title])OR adipose-derived mesenchymal stem cell[Title])AND differentiation[Title]”作为检索式检索，共有文献35篇，其中近5年文献30篇。在SinoMed中以“(”脂肪干细胞“[中文标题：智能])AND“分化”[中文标题：智能]”作为检索式检索，共有文献176篇，其中综述13篇，近5年文献104篇。通过标题及摘要选取与ASCs的成脂分化相关的文献，并阅读其参考文献的标题和摘要，从中再次选取与ASCs成脂分化的诱导和鉴定方法、影响因素等相关的文献，剔除重复文献，最终纳入代表性文献共50篇。于2016年4月8日在www.clinicaltrial.gov上以“adipose stem cell”搜索，结果显示有194项临床试验，用“adipose-derived stemcells”搜索有126项临床试验，阅读试验标题与拟治疾病，选取与ASCs成脂分化相关的临床试验12项。
2诱导ASCs分化成脂的方法
2.1化学诱导法
Zuk等最早使用含有10%的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、0.5mmol/l异丁基甲基黄嘌呤(IMBX)、10μmol/1胰岛素、200μmol/1吲哚美辛的分化诱导液诱导ASCs成脂分化。地塞米松通过解离与胞质内的糖皮质激素受体结合的热休克蛋白90，增加糖皮质激素受体数目，激活其进入细胞核内，调控CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)，促进成脂分化。地塞米松还可激活甲状旁腺激素信号通路，放大细胞对骨形态蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)的反应，上调成脂分化的关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的表达，促进ASCs的成脂分化。地塞米松还能直接抑制Runx2等成骨分化的关键转录因子，使ASCs成脂分化。但是有研究显示地塞米松等糖皮质激素可能在分化早期抑制ASCs的增殖，其机制是与B catenin结合，减少β-catenin的核内蓄积，抑制细胞周期蛋白D3、细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)等，促进CDKs抑制因子P27和P21的表达，抑制DNA的复制。地塞米松还能激活MKP-1，使细胞外信号调控激酶去磷酸化，抑制ASCs的增殖。此外，地塞米松可抑制包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、白介素-6、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、单核细胞化学趋化蛋白1、金属基质蛋白酶1等促血管形成蛋白的表达，从而抑制ASCs诱导的血管新生。因此决定地塞米松的浓度，以达到ASCs增殖和分化的平衡，并降低其对血管新生的抑制作用非常重要。IBMX是磷酸二酯酶的特异性抑制剂，可提高胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的水平，进而激活cAMP反应元件结合蛋白，调控C/EBPs的表达，促进ASCs成脂分化。胰岛素与受体结合后，通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路降低核蛋白磷酸酶的活性，激活CREB的转录，进而增加PPAR丫和c/EBP α的表达，增强脂肪形成基因转录，促进低度分化的脂肪前体细胞成熟。此外，胰岛素还能通过激活磷酸肌醇3激酶信号通路，促进ASCs成脂分化。在成脂分化早期胰岛素主要通过胰岛素样生长因子-1受体发挥作用，随着分化的进行转而通过胰岛素受体发挥作用。 (陈犹白 陈聪慧 QiXH zhang 韩岩)
[关键词]脂肪干细胞；分化；成脂分化；影响因素；机制
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455(2016)04-0086-08
创伤和肿瘤导致的软组织缺损是整形修复科的常见问题，严重影响患者的外形和功能。以乳腺癌术后的乳房缺损为例，在解放军总医院整形修复科约占患者量的7%，而在美国MD安德森肿瘤中心(MD Anderson Cancer Center，MDACC)整形科占患者量高达55%。常规的治疗方法是组织瓣移植、人工材料充填或脂肪移植等，但均有一定局限性。腹部肌皮瓣游离移植是重建乳房的重要手段，尽管移植后坏死等并发症的发生率越来越低，但是不可避免供区损伤。随着材料工业的发展，硅胶假体植入逐渐成为了隆胸和乳房重建的重要手段，其动态外形和手感越来越接近真实组织，但是仍存在异物反应和纤维囊包膜挛缩的风险。更重要的是，截止至2015年11月，MDACC整形科共发现了87例由于乳房假体植入导致的问变性大细胞淋巴瘤，其中位存活期为13年，5年存活率89%。尽管其发病率非常低，约百万分之一至三，且通过外科切除可有效治疗，但仍然为乳房假体植入的患者增添了一丝隐患。应用自体脂肪移植充填软组织凹陷是整形美容外科的常用方法，但是用于重建乳房等较大缺损时易因缺血而吸收，吸收率高且无法预测，常需要二次手术。
组织工程和再生医学为修复或替换受损组织提供了新的途径，而种子细胞是其中的关键。脂肪干细胞(adipose derived stem cell，ASCs)的来源充足、获取简便、产量高、增殖快，具有多向分化潜能，可旁分泌各种细胞因子，促进血管形成，发挥免疫调节作用，并能招募其他细胞参与重建，因此一直是种子细胞的热门人选。Zuk等最早验证了ASCs具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞分化的多向分化潜能。除了上述细胞外，研究证实ASCs在特定的诱导条件下可向平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肌腱细胞、神经细胞、胰岛细胞、表皮细胞、内皮细胞、内耳毛细胞、角膜细胞、造血细胞和肝细胞样细胞等内、中、外三胚层的多种细胞分化(图1)。基于ASCs的干细胞疗法，或利用ASCs的成脂分化能力构建组织工程脂肪，逐渐成为再生医学的研究热点，但是目前缺乏对于ASCs成脂分化的系统综述。本文总结了诱导和验证ASCs成脂分化的方法，讨论了主要影响因素及其机制，介绍了解放军总医院整形修复科和MDACC整形科组织再生和分子细胞工程实验室的相关经验，并展望了未来研究方向。
1数据来源
于2016年2月20日在PubMed中以“(((adipose stem cell[Title])OR adipose derived stem cell[Title])OR adipose-derived mesenchymal stem cell[Title])AND differentiation[Title]”作为检索式检索，共有文献35篇，其中近5年文献30篇。在SinoMed中以“(”脂肪干细胞“[中文标题：智能])AND“分化”[中文标题：智能]”作为检索式检索，共有文献176篇，其中综述13篇，近5年文献104篇。通过标题及摘要选取与ASCs的成脂分化相关的文献，并阅读其参考文献的标题和摘要，从中再次选取与ASCs成脂分化的诱导和鉴定方法、影响因素等相关的文献，剔除重复文献，最终纳入代表性文献共50篇。于2016年4月8日在www.clinicaltrial.gov上以“adipose stem cell”搜索，结果显示有194项临床试验，用“adipose-derived stemcells”搜索有126项临床试验，阅读试验标题与拟治疾病，选取与ASCs成脂分化相关的临床试验12项。
2诱导ASCs分化成脂的方法
2.1化学诱导法
Zuk等最早使用含有10%的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、0.5mmol/l异丁基甲基黄嘌呤(IMBX)、10μmol/1胰岛素、200μmol/1吲哚美辛的分化诱导液诱导ASCs成脂分化。地塞米松通过解离与胞质内的糖皮质激素受体结合的热休克蛋白90，增加糖皮质激素受体数目，激活其进入细胞核内，调控CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)，促进成脂分化。地塞米松还可激活甲状旁腺激素信号通路，放大细胞对骨形态蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)的反应，上调成脂分化的关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的表达，促进ASCs的成脂分化。地塞米松还能直接抑制Runx2等成骨分化的关键转录因子，使ASCs成脂分化。但是有研究显示地塞米松等糖皮质激素可能在分化早期抑制ASCs的增殖，其机制是与B catenin结合，减少β-catenin的核内蓄积，抑制细胞周期蛋白D3、细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)等，促进CDKs抑制因子P27和P21的表达，抑制DNA的复制。地塞米松还能激活MKP-1，使细胞外信号调控激酶去磷酸化，抑制ASCs的增殖。此外，地塞米松可抑制包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、白介素-6、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、单核细胞化学趋化蛋白1、金属基质蛋白酶1等促血管形成蛋白的表达，从而抑制ASCs诱导的血管新生。因此决定地塞米松的浓度，以达到ASCs增殖和分化的平衡，并降低其对血管新生的抑制作用非常重要。IBMX是磷酸二酯酶的特异性抑制剂，可提高胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的水平，进而激活cAMP反应元件结合蛋白，调控C/EBPs的表达，促进ASCs成脂分化。胰岛素与受体结合后，通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路降低核蛋白磷酸酶的活性，激活CREB的转录，进而增加PPAR丫和c/EBP α的表达，增强脂肪形成基因转录，促进低度分化的脂肪前体细胞成熟。此外，胰岛素还能通过激活磷酸肌醇3激酶信号通路，促进ASCs成脂分化。在成脂分化早期胰岛素主要通过胰岛素样生长因子-1受体发挥作用，随着分化的进行转而通过胰岛素受体发挥作用。 (陈犹白 陈聪慧 QiXH zhang 韩岩)