黑木耳多糖对ICR小鼠皮肤光老化的保护作用(2)
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皮肤光老化是皮肤外源性老化的一个重要组成，是由自然光或人工紫外线(ultraviolet ,UV)光源反复照射引起的皮肤损伤[1]。日光中的长波紫外线(UVA)及中波紫外线(UVB)与光老化的发生密切相关。其发生机制之一是紫外线引起皮肤组织产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢和单线态氧[2]， 使机体发生氧化应激，造成细胞和组织的损伤。SOD、GSH-PX是机体重要的抗氧化酶，MDA是机体细胞膜受自由基攻击后产生的脂质过氧化产物，三者的测定相互配合能间接反映机体细胞受氧化损伤的程度。研究发现黑木耳多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗凝血、抗突变、防辐射等生物活性[3]，有清除超氧阴离子、抗氧化及保护线粒体的功能[4]。本研究采用UVA联合UVB照射ICR小鼠建立光老化模型，探讨黑木耳多糖灌胃治疗对小鼠皮肤光老化是否具有保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料：雌性断乳ICR小鼠,体重18～22g,由西安交通大学实验动物中心提供；40W紫外线灯管UVB4支、UVA2支，购于合肥赛帆试验设备有限公司； SOD、GSH-PX、MDA测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；黑木耳多糖(纯度60%)购于西安斯诺特生物技术有限公司，常温干燥保存；可见光分光光度计、离心机、恒温水浴箱等。
1.2 造模:40W紫外灯管(UVB4支，UVA2支)并列装于木箱制成灯箱[5],将除正常组以外的各组小鼠分笼放入灯箱中照射，小鼠背部距灯源30cm。每次照射前灯管预热15分钟。首次照光前一天用电推剪和市售脱毛膏给小鼠背部脱毛,脱毛面积约9cm2，以后每周脱毛1～2次。每周照射3次(周一、三、五)，第1周每次照射1h，以后每周每次增加1h，自第5周起每次5h，直至第14周照光结束。
1.3 动物分组及处理:ICR小鼠50只随机平均分成5组：正常组(A)、模型对照组(B)、模型+AAP低剂量(50mg/kg·d)灌胃组(C)、模型+AAP中剂量(100mg/kg.d)灌胃组(D)、模型+AAP高剂量(200mg/kg.d)灌胃组(E)。将黑木耳多糖溶解在生理盐水中配制成灌胃液。正常组及模型对照组灌胃相应体积的生理盐水。各组均在每次照光前称体重、灌胃。
1.4 取材：最后一次照光结束24h后用6%硫化钠溶液给小鼠背部脱毛。脱毛24h后腹腔注射水合氯醛处死小鼠，立即取下背部脱毛处全层皮肤。一部分放入10%福尔马林溶液中固定过夜，制作病理组织切片，HE染色。一部分皮肤去除皮下脂肪，在冰冻的生理盐水中漂洗，冷冻于-70℃冰箱以制备组织匀浆。
1.5 10%皮肤组织匀浆的制备：将皮肤用滤纸拭干，称重放入小烧杯中，加人冷生理盐水(生理盐水的总量是皮肤组织块重量的9倍)，尽快剪碎后移入玻璃匀浆器制成匀浆[6]用于测定GSH-PX、SOD活力及MDA含量。
1.6 指标测定：SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法；GSH-PX是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，其活力以催化GSH的反应速度来表示； MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)。各项指标的具体测定步骤按测试盒说明书。组织蛋白含量用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定。每项指标的吸光度用可见分光光度计测定。
1.7 统计学处理：所有数据均用SPSS13.0统计分析软件处理，数据用 表示，各组均数间的差异用方差分析进行检验，并用LSD-t检验作两两比较。
2 实验结果
2.1 SOD、GSH-PX活力及MDA含量：与正常组比较,模型对照组皮肤组织中SOD、GSH-PX活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著增高(P<0.05)，表明长期紫外线照射可明显抑制抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，增加脂质过氧化产物MDA的含量；与模型组比较，AAP各灌胃组SOD、GSH-PX活力显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。AAP低、中、高治疗组间各指标均存在显著性差异(P<0.05)，且随AAP剂量的增加，SOD、GSH-PX活力增高，MDA含量降低。说明AAP能有效保持或提高光老化小鼠皮肤组织中的SOD、GSH-PX活力,降低MDA含量(见表1)。
2.2 肉眼观察：正常组小鼠背部皮肤光滑、薄嫩、红润、有弹性；随着照光剂量的增加模型对照组小鼠皮肤逐渐出现皮屑、褐黄、粗糙肥厚、深皱纹、缺乏弹性等光老化特征。AAP灌胃组皮肤外观接近正常组(图1)。
2.3 组织切片HE染色结果：利用图像分析系统(×20)观察，正常组表皮连续，结构完整、较薄、分层清晰，真皮层可见均匀分布的长条形胶原纤维束，方向与皮面平行(图2A)；模型对照组：表皮增厚，角化过度伴角化不全，真皮层明显变厚，纤维排列紊乱，分布不均，出现变粗、卷曲、断裂，说明光老化模型建立成功(图2B)。AAP治疗组表皮厚度接近正常，真皮纤维束排列较整齐均匀，少见断裂、卷曲等，较模型对照组有明显改善，尤其高剂量组更接近正常组表现(图2C～E)。
3 讨论
本课题通过UVA联合UVB照射ICR小鼠成功建立了小鼠皮肤光老化模型。结果显示长期紫外线照射使小鼠皮肤出现粗深皱纹、粗糙增厚、缺乏弹性、斑驳状色素沉着或颜色褐黄无光泽、皮屑或痂壳等典型光老化特征，组织切片上表现为真皮、表皮均明显增厚，表皮角化过度伴角化不全，真皮纤维变性，排列紊乱；皮肤组织中的抗氧化酶SOD、GSH-PX活力降低，脂质过氧化产物MDA含量升高。
大量研究证实，紫外线对皮肤的损伤与活性氧簇(ROS)的产生密切相关。ROS激活细胞表面相关受体，启动相关信号传导，导致基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)合成增多，同时抑制胶原蛋白的合成，MMPs可降解皮肤中的胶原纤维，引起皮肤光老化的典型组织病理改变[7]。人体的抗氧化防御系统包括：非酶抗氧化剂，如谷胱甘肽(glutathione, GSH)；酶抗氧化剂，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等[8]。ROS能消耗和破坏皮肤的非酶和酶抗氧化防御系统[9]，当产生的ROS超过了细胞的清除能力时，使机体发生氧化应激，造成细胞和组织的损伤。SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。GSH-PX是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。MDA是机体细胞膜受自由基攻击后产生的脂质过氧化物 ......
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