中波紫外线对人血小板线粒体DNA影响的初步观察(2)
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2.2 血小板线粒体DNA环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)的测定结果 线粒体DNA在490nm的OD值见表3，对应的OD值均数图见图2。
其中，样本A-H表示对应表1照射的光孔顺序，样本0为对照组。对结果进行单因素方差分析显示，F=345.5，P<0.05，表示UVB照射前后血小板线粒体CPDs OD值的均数有统计学差异。对数据进行spearman相关性分析显示，r=0.389，P<0.01，表示CPDs的含量变化与UVB照射剂量有关。从图2可见，随UVB照射的能量增加，实验组线粒体DNA光损伤产物CPDs的含量逐渐增加。用SNK法对OD值的均数进行两两比较，显示C组与D组P>0.05，没有统计学差异；F组与G组P>0.05，没有统计学差异。其余各组之间P<0.05，有统计学差异。从图2可见，虽然UVB照射的剂量以1.41倍不断递增，但血小板线粒体光损伤产物CPDs的含量并非直线上升，在C组到D组，以及F组到G组时可出现两个平台期。
3 讨论
皮肤光老化是在日光照射条件下长期作用的结果。虽然紫外线照射可直接损伤皮肤组织细胞的DNA，但细胞核DNA有酶修复系统，一过性的轻微损伤可能经过修复而无法检测，因此，光老化的研究中，寻找能保留光损伤的敏感载体非常有必要。
线粒体是人体细胞中除细胞核外唯一具有自身遗传物质(如DNA)的细胞器。其主要功能是通过呼吸链(电子传递链和氧化磷酸化系统)为细胞活动提供能量，并参与一些重要的代谢通路[5]。线粒体DNA的特点是缺乏组蛋白的保护并且没有完整的突变修复功能，因此mtDNA的突变率远高于核DNA突变[6]，这些特点使线粒体对损伤的反应非常敏感，线粒体DNA突变及累积被认为是人类皮肤老化尤其是皮肤光老化的重要因素[2]。而研究线粒体DNA的变化需要排除核DNA的影响，这是我们选择用不含核DNA的血小板作为体外实验对象的原因。
光老化线粒体的损伤可表现为线粒体膜电位的降低，过氧化产物的增加，ATP合成的减少等[7]。从整体上而言，都是线粒体活性降低的表现之一。我们以对皮肤的损伤强度比UVA大约800～1000倍的中波紫外线(UVB)[8]照射血小板，从整体上观察照射前后血小板线粒体活性，以及mtDNA光损伤产物CPDs的变化，作为研究体外评价紫外线光损伤作用的参考指标。
实验中所用的Mito-Tracker Green绿色荧光探针，可特异性被线粒体以不依赖膜电位的形式摄取，线粒体活性好，则摄取的探针多，则显现的荧光亮且均匀。通过观察线粒体摄取能力的变化，可作为评价线粒体活性的一个指标。本实验以不同能量的UVB照射血小板达1min，线粒体活性出现了具有统计学差异的变化，而且UVB照射的剂量不同，荧光值也随之波动：UVB能量越大，线粒体摄取的探针越少，荧光值则越低。这说明，UVB照射能影响血小板线粒体的活性，而且这个改变比较灵敏，随照射剂量的不同而改变，有利于实验室条件下光损伤的研究。
UVB照射皮肤细胞可直接引起DNA损伤，核酸DNA的芳香族杂环碱基对是UVB的强吸收色基。在UVB照射下，同条DNA链上相邻的嘧啶碱基形成聚和体，即光产物，包括环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)、6-4光产物(6-4PPs)及其异构体。有核细胞DNA在损伤后可进行自我修复，约90% 6-4PP在照射后3h即被修复[9]，而CPDs的碱基易突变，形成量大(占70%～80%)，是6-4PPs的3倍，故常认为CPDs是细胞光损伤的主要产物[10]。在血小板线粒体中，DNA没有酶修复系统，这些光损伤比表皮细胞更容易保留。我们观察到不同剂量的UVB照射下，血小板线粒体DNA光损伤产物CPDs的含量随之变化，同时还有与剂量相关的平台期，说明UVB照射能直接损伤血小板线粒体DNA，而且这个改变容易保留下来被检测到，并且这个改变与照射剂量的有相关性，有利于实验室条件下从DNA角度对光老化进行研究。
在不同剂量的UVB照射下，我们观察到血小板不仅有线粒体活性的损伤，同时合并有线粒体DNA光损伤产物的变化，而且，这些变化程度都与照射的剂量有相关性，随着照射剂量的增加，线粒体DNA的损伤在不断加重，活性不断降低。这表明，把血小板作为作为体外评价紫外线光损伤作用的敏感系统是可行的。如果能建立体外评价光损伤的细胞系统，将有利于体外进行光损伤相关机制的研究及抗光损伤药物的筛选等。
[参考文献]
[1]鲍幼玲,黄耀熊,蒋鸿雁,等.微波辐射对血小板线粒体基因的影响[J].中国医学物理学杂志, 2007,24(2):137-139.
[2]刘仲荣,刘荣卿,张国威,等.PUVA诱导皮肤mtDNA4977bp缺失突变累积的研究[J].临床皮肤科杂志,2002,31(12):743-745.
[3]黄茂芳,刘仲荣,杨慧兰,等.中波紫外线对人血小板线粒体活性影响的初步观察[J].皮肤性病诊疗学杂志,2011,18(2):73-75.
[4]林向飞,骆 丹,闵 玮,等. UVB 辐射后HaCaT 细胞光产物的产生和清除及 EGCG 的干预作用[J]. 中国美容医学,2006,15(4):384-386.
[5]DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory-chain diseases[J].N Engl J Med, 2003, 348: 2656?2668.
[6]王学波,李建远.人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立[J].生物医学工程研究，2008,27(4):298-301.
[7]黄发军 ......
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