诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验研究(2)
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1.3 唾液腺腺泡细胞的分离、培养和鉴定
1.3.1 唾液腺腺泡细胞的分离、培养：颈椎脱臼法处死SD鼠，无菌操作下摘取双侧颌下腺，显微镜下去除腺体周围的被膜，脂肪组织，用D-Hanks(HBSS)液反复漂洗标本，剪成1mm3大小的组织块。置于37℃恒温摇床用0.125%Ⅱ型胶原酶消化40min，取上清液通过100目筛网过滤，滤液移入离心管，离心1000r/min，6min，弃去上清液，加入培养液(DMEM/F12培养液、10%FBS、5mg/L氢化可的松、100 U/ml青霉素、0.1μg/ml链霉素、2mg/L异丙肾上腺素、5g/L胰岛素、2mmol/L的L-谷氨酰胺、5mg/L转铁蛋白、10μg/L的EGF、10μg/L的HGF)，细胞计数后以1×105/ml的细胞浓度接种到35mm培养皿中。纯化唾液腺腺泡细胞，9天后传代。
1.3.2 唾液腺腺泡细胞的鉴定：取1代纯化的SD大鼠颌下腺腺泡细胞于倒置相差显微镜下可见细胞生长良好，形态均匀，为铺路石状。扫面电镜：一代的细胞爬片后经4%多聚甲醛溶液4℃固定过夜，乙醇梯度脱水，干燥镀膜，镜下可见：细胞表面不平，突起多且长短不一，有些细胞表面可见分泌颗粒。α-淀粉酶染色阳性。
1.4 取第3代的MSCs与1代的SGCs作为实验对象，进行实验分组：A组:含唾液腺培养液的共培养组；B组：含10%FBS、 DMEM/F12共培养组；C组：含唾液腺培养液非共的培养组；D组：含10%FBS、 DMEM/F12非共培养组。共培养装置是带有transwell小室的24孔板。0.4μm的transwell透明聚碳酸酯膜有效的阻止了两种细胞的通过，而培养液、细胞的代谢物以及各种生长因子能够相互通透。共培养组：将SGCs以2×104接种到24孔板transwell膜上，MSCs以1×104接种到带有下层。非共培养组：只接种1×104的MSCs到24孔板底部。各培养一个月后通过电镜观察诱导细胞的形态，经ck-8染色，α-Amylase染色。
1.5 采用χ2检验分析四个实验组诱导的MSCs经α-amylase染色后的阳性细胞数。应用spss17.0统计软件对免疫组化染色结果进行分析。采用总体方差分析法，P<0.05为差异显著，有统计学意义。
2 结果
各实验组培养1个月后，扫描电镜显示：共培养组诱导的细胞呈现唾液腺腺泡样细胞的形态，非共培养组未见。共培养组诱导的细胞经α-amylase染色呈现阳性，细胞胞浆深着色，而非共培养组基本未见阳性细胞,从柱状图可明显看出各组MSCs培养1个月通过α-amylase染色细胞计数情况(图9)。对其分析，每组取四个镜下视野的平均值，并记录(表1)。
3 讨论
3.1 头颈部癌症患者放疗后常造成唾液腺上皮细胞的损伤甚至萎缩，虽然在放疗时采取了一定保护措施,却仍然不能完全防止这种副作用的发生。研究证实，干细胞疗法是解决唾液腺上皮细胞的损伤或萎缩的一种可行性治疗手段。骨髓间充质干细胞具有很高的可塑性,一定条件下能分化为脂肪细胞、成骨细胞、肝细胞[3-4]等细胞,在各个系统疾病的治疗中拥有巨大的潜力。近年来，同源性骨髓间充质干细胞的移植逐渐成为受损器官或组织修复的重要治疗手段之一，其方法是：体外提取培养骨髓间充质干细胞，然后在移植到患者体内以修复受损的组织或器官[5-6]。
3.2 异体细胞的移植,会出现严重的免疫排斥反应,而自体细胞移植就能减少或避免这种情况的发生。但是，唾液腺腺泡细胞是一种终末分化的细胞,体外增殖能力差,一般培养到第五代就很难再传代[7]，单纯靠体外扩增自身剩余的唾液腺腺泡细胞很难。近年研究认为，自身来源的骨髓间充质干细胞诱导成为唾液腺腺泡细胞后就能够解决这个难题。
3.3 蒋泽生等[8]通过共培养将人骨髓多能成体祖细胞诱导分化为肝细胞样细胞。Sumita Y等[9]将骨髓间充质干细胞注射到鼠尾静脉,在体内获得了唾液腺损伤修复所需的种子细胞。结合以上结论，本实验通过体外培养，利用差速贴壁和差速消化法[10]提纯SD大鼠颌下腺腺泡细胞(SGCs)和骨髓间充质干细胞，共培养诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞,进而获得唾液腺损伤所需要的种子细胞,为唾液腺组织缺损修复提供了一个可靠的组织学依据。
3.4 在唾液腺培养液中添加多种生长因子,可以刺激唾液腺腺泡细胞体外分泌[11]。本实验设置含生长因子和未含生长因子的共培养组,之后进行α-amylase染色，结果发现：共培养条件下,添加生长因子的共培养组与未添加组相比,阳性细胞数增多,诱导效率提高。由此推断，唾液腺腺泡细胞产生的分泌物增加,而这些分泌物中又可能含有诱导骨髓间充质干细胞转化的物质,同时提高了诱导的效率。
3.5 由于机体内环境的复杂性，本实验诱导的唾液腺腺泡样细胞与体内的唾液腺腺泡细胞存在一定的差异，但为唾液腺腺泡细胞的损伤修复体外基础研究提供了一个较为可靠的细胞理论依据。
[参考文献]
[1]庄淑波,刘毅.骨髓间充质干细胞在整形外科的应用前景[J].中国美容医学,2006,15(3): 347-349.
[2]金丽娟,张诚.骨髓间充质干细胞在创面修复中的应用[J].中国美容医学,2006,15(5)：603-605.
[3]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science,1999,284(5411):143-147.
[4]Hennrick KT,Keeton AG,Nanua S,et al.Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype[J]. AJRCCM,2007,175(11):1158-1164.
[5]Gerburg K,Felix S,Alexander,G,et al. Transdifferentiated mesenchymal stem cells as alternative therapy in supporting nerve regeneration and myelination[J] ......
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