EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究(2)
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1.3 BMSCs的分离培养及鉴定
1.3.1 BMSCs的分离培养：比格犬以0.12ml/kg的剂量肌注氯胺酮/速眠新(两者2:1混合)麻醉，常规备皮、消毒、铺巾，用骨穿针于髂后上嵴穿入骨髓腔，然后用含有1ml肝素(50U/ml)的20ml的注射器负压抽取骨髓液4ml，加入4ml Hank's液混匀，小心加入含有4ml Ficoll淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2 000r/min离心20min，吸取中间白色云雾状的有核细胞层，DMEM洗涤2次，离心后细胞计数，将细胞悬液按1.0×106/ml的密度接种直径为10cm的培养皿，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养，48h后换液，清除未贴壁的细胞，7天后细胞克隆达80%融合，胰酶消化，按5.0×104/ml的密度传代。选取第二代细胞备用。
1.3.2 三系诱导分化及鉴定：①成骨诱导：成骨诱导培养基(10-8 M地塞米松、0.01 M β-磷酸甘油钠、0.05g/L维生素C、10%胎牛血清、1 双抗)培养BMSCs 21天，4%多聚甲醛固定，碱性磷酸酶染色试剂盒染色；体积分数为95%的乙醇固定1h，2%茜素红染色；4% 多聚甲醛固定，加入抗骨桥蛋白一抗和二抗，免疫荧光检测；②成软骨诱导：成软骨诱导培养基(10ng/ml TGF-β1、40ng/ 地塞米松、50ng/ml维生素C、10%胎牛血清、1% 双抗)诱导培养14天，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝、番红O染色；4%多聚甲醛固定，加入抗Ⅱ型胶原一抗和二抗，免疫细胞化学检测；③成脂诱导：成脂诱导培养基(0.5mM IBMX、10-5 M胰岛素、0.2mM吲哚美辛、10-6 M地塞米松、10%胎牛血清、1%双抗)诱导培养14天，4%多聚甲醛固定，60%异丙醇处理，油红O染色。
1.4 EGFP和CM-Dil标记BMSCs
1.4.1 EGFP标记BMSCs：成骨诱导后的BMSCs传至P2代，达到80% 细胞融合后去除原成骨诱导培养基，加入无胎牛血清的DMEM 5 ml，然后在其中加入制备好的病毒液600μl，并加入Lipofectamine 2000以增强感染效率。24h后，弃掉含病毒的培养基，改用成骨诱导培养基继续培养，荧光显微镜下观察转染效率，MTT法检测细胞的增增殖能力。
1.4.2 CM-Dil标记BMSCs：收集P2代BMSCs制成密度为1.0×107/ ml细胞悬液(PBS悬浮)，每1ml细胞悬液中加入40μl CM-Dil(1g/L)，此时CM-Dil的终浓度为40μM。细胞悬液置于37℃，3min，然后冰浴15min，洗涤后按5.0×104/ml的密度接种到培养皿中。24h后，荧光显微镜下观察标记后的细胞，MTT法检测细胞的增殖能力。
1.5 BMSCs接种珊瑚支架植入裸鼠体内及检测
1.5.1 珊瑚支架制备：选取西沙群岛产致密橙黄滨珊瑚，加工成体积为5mm×5mm×1mm大小。用5%次氯酸钠溶液浸泡2周，3天换液一次，然后用三蒸水冲洗，煮沸10min×3次，超声清洗(5次，每次10min)后80℃烘干24h，高温高压灭菌后备用。
1.5.2 接种细胞：分别收集EGFP和CM-Dil标记后的BMSCs，以2.0×107/ml的密度接种珊瑚支架，成骨诱导培养基体外培养3h、3天、7天，2.5% 戊二醛固定，酒精脱水干燥，扫描电镜观察材料的孔隙率和接种后细胞-材料的粘附情况。
1.5.3 细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下：裸鼠12只，分3组。各组裸鼠右侧背部皮下均植入空白珊瑚支架(每只3块)，左侧分别植入体外成骨诱导培养7天的未标记、EGFP标记、CM-Dil标记的细胞-支架复合物。
1.5.4 取材：三组分别于术后4周、8周、12周取材，30% 甲酸脱钙，石蜡包埋切片，HE染色，观察其成骨情况；EGFP标记组通过GFP免疫组织化学示踪植入BMSCs；CM-Dil标记组冰冻切片DAPI染核，荧光显微镜下观察植入BMSCs的变化。
1.6 统计学分析：采用SPSS16.0统计软件包进行分析。MTT法各检测时间点每组读取4孔OD值，数据以x±s表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 BMSCs多向分化鉴定及EGFP、CM-Dil标记
2.1.1 分化鉴定：BMSCs原代培养7天，贴壁细胞形态呈长梭形，增殖迅速并生成大量克隆。成骨诱导21天后，碱性磷酸酶染色阳性(图1A)，茜素红染色可见成骨分化后钙质沉积(图1B)；成软骨诱导14天后，番红O染色阳性(图1C)，Ⅱ 型胶原免疫细胞化学可见细胞分泌??型胶原(图1D)；成脂诱导14天后，镜下可见细胞质中大量脂滴出现(图1E)，油红O染色阳性(图1F)。
2.1.2 标记：EGFP、CM-Dil标记BMSCs 24h后，荧光显微镜下计数发现80% 以上的细胞激发出绿色荧光、红色荧光(图2)。MTT法检测结果显示7天细胞增殖进入平台期，EGFP组、CM-Dil组与未标记组的生长曲线基本一致，各个时间点比较无统计学差异(P>0.05)，表明标记对细胞增殖活性无明显影响。
2.2 体外培养BMSCs-支架复合物：电镜扫描细胞-支架复合物发现，接种3天后细胞已分泌大量基质，逐渐充满整个孔隙。复合物体外培养7天置于荧光倒置显微镜下直接观察，也看到激发出荧光的细胞在支架上黏附生长(图3)。
2.3 体内植入复合物的组织学观察：各组复合物植入体内4周，材料边缘(珊瑚支架脱钙处理)均出现少量新生骨基质(红染区域)，骨基质包围大量新生的类骨质，形态似纤维组织，而空白材料植入后发现纤维组织长入，无骨基质形成；植入8周，随着类骨质的成熟，骨基质的范围逐渐扩大；植入12周，大部分区域成熟骨质已经形成，骨陷窝及其中的骨细胞清晰可见(图4)，而空白材料珊瑚支架在体内逐渐降解，被大量纤维组织替代。
2.4 EGFP、CM-Dil标记BMSCs体内示踪观察：EGFP免疫组织化学发现，4周大量表达GFP的细胞存在于植入的细胞-支架复合物中，8周逐渐减少，到12周仅能在组织边缘看到少量GFP阳性细胞(图5A)。CM-Dil标记组冰冻切片在荧光显微镜下观察显示植入4周，标记后的BMSCs发出红色荧光，荧光出现在材料边缘区域，植入8周，红色荧光仍然存在 ......
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