CXCR4靶向shRNA质粒载体的制备和体外鉴定(2)
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1.3合成DNA片段和双链模板DNA:按照上面CXCR4-shRNA正反义链序列合成DNA片段。将合成片段分别溶于双蒸水中,配制成100pmol/μl的溶液。每条正义链分别与其反义链退火后,形成一个限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ酶及黏性末端。12%非变性PAGE凝胶检测双链形成效率,凝胶成像仪检测电泳条带。
1.4CXCR4-shRNAR表达质粒载体的构建及鉴定:BamHI和HindⅢ酶切处理pSilencerTM 3.1-H1 neo表达质粒载体(AM5770; Vector Size: 4285 bp; 20rxns),形成线性片段,除去酶切下来的小片段而纯化,使其不发生自身连接。用T4 DNA连接酶将退火后的双链核苷酸片段插入线性化载体。使用BamHI和HindⅢ酶切处理pSilencerTM 3.1-H1 neo表达质粒载体进行酶切消化。
1.5连接(克隆制备)和转化:将退火形成双链DNA与经BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体连接。于4℃ 12h连接反应,制备克隆连接液,准备转化。用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加2μl 连接液,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上90s。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却l～2min。每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的 SOB琼脂培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿,于37℃培养,16h。阳性克隆PCR鉴定后菌液送测序。选择测序鉴定正确的克隆,将保存的正确的单克隆菌液接种于2～5ml抗性LB培养基中,37℃培养,按照实验说明进行阳性克隆质粒抽提筛选。设转染CXCR4-shRNA表达载体的细胞为实验组,转染无关对照shRNA载体的细胞为无关对照组。
1.6RT-PCR检测CXCR4 mRNA表达:以人MV3细胞作为空对照,分别取实验组、无关对照组和空白对照组细胞,按Trizol试剂说明书操作提取细胞总RNA,用于扩增人CXCR4 cDNA。PCR引物由上海申工合成。PCR扩增后行1%琼脂糖凝胶电泳,用图像扫描仪拍照并进行条带灰度分析,以CXCR4与GAPDH的比值代表其相对含量。
1.7Western blot 检测CXCR4蛋白的表达:取实验组、无关对照组和空白对照组细胞,加入细胞裂解液,提取细胞总蛋白,用BC试剂盒检测蛋白质浓度。取PBS、各样品10μl,加DW990μl;取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml;向各管加入2.5ml D试剂混匀,静置10min;迅速加入酚试剂0.25ml,混匀37℃水浴30min;721分光光度计650nm,比色,SO标准管调零;最后稀释为4μg/μl,加载样缓冲液后终浓度2μg/μl,上样量30～80μg/泳道。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样50μg,经电泳、转膜、封闭后,依次与CXCR4抗体(1:200)及HRP标记的二抗(1:500)反应1h,化学发光试剂曝光显影,紫外分光光度计扫描各条带灰度植值以反映蛋白质的表达水平。内参照为β-actin。
1.8统计学处理:采集数据以均数±标准差表示,SPSS10.0统计软件进行t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1shRNA载体质粒酶切鉴定与纯化:pSilencerTM 3.1-H1 neo载体酶切反应物经琼脂糖凝胶电泳证实,线性化后的质粒与未经酶切的质粒的电泳迁移率不同(图1A),线性化后的质粒泳迁移速率稍快于未经酶切的质粒。DNA双链退火后经12%PAGE凝胶电泳,可见在3、4泳道形成条带的与双链对照泳道形成的条带在同一水平线上(图1B)。
2.2PCR鉴定重组质粒与阳性克隆质粒抽提:实验组和无关对照组经PCR检测均可见约320bp的条带,与预测目的条带大小相符,与之相对应的两个空质粒均没有条带,说明插入序列均整合到载体上。琼脂糖凝胶电泳结果显示图中可见双链、超螺旋质粒占绝大部分,说明质粒抽提质量高(图2)。
2.3CXCR4-shRNA阳性克隆PCR鉴定:退火形成双链DNA与经BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体连接,连接产物转化DH5α大肠杆菌,挑取重组阳性克隆,行PCR鉴定阳性克隆,重组细菌克隆的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳发现泳道4～9的PCR产物条带电泳迁移率慢于泳道3即空载组的PCR产物条带,说明泳道4～9均为插入片段阳性的克隆(图3)。挑选阳性克隆CXCR4-shRNA菌液送测序。
2.4重组质粒序列测定:测序结果与目的序列完全相同,表明构建重组质粒成功。插入部分序列图谱测序结果表明合成的CXCR4-shRNA寡核苷酸链序列插入正确(图4)。
2.5shRNA对人转移性黑色素瘤细胞MV3 内CXCR4 mRNA表达的影响
半定量RT-PCR DNA琼脂糖凝胶电泳结果分析显示,各组样本均可见这亮度均一的GAPDH对照条带,实验组CXCR4目的DNA条带亮度较空白对照组浅,无关对照组目的DNA条带无明显变化(图5)。
CXCR4-shRNA稳定转染MV3细胞后,CXCR4 mRNA的表达水平明显低于空白对照组,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验组、无关对照组和空白对照组中CXCR4 mRNA的表达水平分别为20.6%±5.1%、70.6%±2.6%和72.2%±3.9%。无关对照组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
2.6 shRNA对人转移性黑色素瘤细胞MV3 内CXCR4蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示,实验组CXCR4-shRNA稳定转染MV3细胞后,CXCR4蛋白的表达明显被抑制(图6)。实验组、空白对照组和无关对照组中CXCR4蛋白的表达率分别为12 ......
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