体外培养兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化及其临床意义(2)
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1.2 实验材料:Ⅱ型胶原蛋白酶(上海生工公司),胰蛋白酶(Sigma公司,美国),DME M培养基(Sigma公司,美国), 胎牛血清(杭州四季青生物公司),聚苯乙烯一次性培养瓶,皿,板(Falcon公司,美国),新生及六周龄纯种新西兰白兔(中南大学湘雅二医院动物室提供),医用硅胶膜(化工部有机硅中心,成都),医用耐酸不锈钢及常规细胞培养实验器械等。
1.3 细胞膜牵张力施加装置(四川大学生物力学研究所提供):细胞膜式牵张力施加装置如图1所示。将体外培养的细胞种植于硅胶膜上,通过硅胶膜密闭隔开细胞培养小室与液压小室,利用液体静张力使膜发生弹性形变,贴附于膜上的细胞受到相应牵张力。通过调节液体的液面差,可以较准确控制实验所需的牵张力。
1.4 实验方法
1.4.1新西兰白兔兔鼻软骨细胞培养及鉴定:兔鼻软骨原代细胞传代培养到第4代,每天常规在倒置相差显微镜下观察兔鼻软骨细胞在培养瓶及硅胶膜上的培养性状和形态学特点。采用甲苯胺蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原表达方法鉴定兔鼻软骨细胞。
1.4.2培养小室及硅胶膜处理:本实验所用硅胶膜厚约0.2mm,直径38mm,将硅胶膜放入75%酒精浸泡24h,去除可能的其他化学成分,三蒸水反复漂洗后浸泡12h,组装不锈钢整体培养小室,整体高温,高压(121℃,0.1 MPa,25min)灭菌。
1.4.3细胞力学实验前准备:将第3代培养的兔鼻软骨细胞传代,0.25%胰酶消化后,按2×105个/孔的密度接种于培养膜上,培养膜上预先加入5%胎牛血清DMEM培养液2ml,于 CO2培养箱内(37℃,含95%空气,5% CO2)培养,培养15h后,用PBS液洗3次,加入15%胎牛血清的DMEM培养液,依据相关实验方案进行实验。
1.4.4实验方案:分别测定第4代体外培养新生及六周龄新西兰白兔鼻软骨细胞(70份样本)在5kPa牵张力作用下培养(15%胎牛血清浓度)0,2,4,6,8,10,12h后DNA含量(以0h为对照)(流式细胞仪)。样本量均为5个。
1.5 流式细胞仪检测:在培养膜加入适量0.25%胰酶,室温下消化15s 左右,4℃ PBS漂洗,离心(4 000r/min,4min 各一次),收集鼻软骨细胞;5ml 80%酒精固定保存于塑料离心管,流式细胞仪检测细胞增殖活性(北京鼎国生物公司)。细胞增殖活性以增殖指数(proliferative index,PI)表示,先检测各细胞周期表,然后按以下公式计算:
1.6统计分析:所有数据输入SPSS 13.0软件包进行组间方差分析。
2结果
2.1 体外培养兔鼻软骨细胞培养和鉴定:硅胶膜表面生长的软骨细胞形态正常,具有典型多角样细胞形态特征,并可见正在分裂增殖的细胞;静态牵张应力刺激培养下硅胶膜上兔鼻软骨细胞呈多角形的伸展状态,细胞整体形态被拉伸。所培养的细胞经甲苯胺蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原表达结果为阳性,鉴定为软骨细胞(图2)。
2.2 新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化:从表1可见,0～10h内5kPa静态牵张应力组软骨细胞增殖指数随着牵张力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于10h处,12h处PI指数下降;静态牵张应力对体外培养的新生及6周龄兔兔鼻软骨细胞均有促增殖作用,但对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。
3讨论
3.1 选择静态牵张应力值的依据:郭欣[5]等报道,膜式细胞牵张力施加装置符合体外细胞应力加载的要求,操作方便,性能可靠,可长时间稳定运行,已在多种细胞体外加力实验中得到应用。本课题的预实验观察到在5kPa荷载下硅胶膜变形率分别为8%,且在这种张应力条件下兔鼻软骨细胞始终贴壁生长,体外培养鼻软骨细胞增殖活性均有改变,因此根据膜式细胞牵张力施加装置特性及预实验结果,初步选用5kPa大小的牵张力。
3.2 体外培养兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下的增殖活性变化及其临床意义:有学者从细胞分子水平对软骨细胞做了相关研究,结果表明:不同大小牵张力作用下均可导致软骨细胞的增殖活性变化[6-8]。本实验发现牵张力实验组与对照组有显著统计学差异(P<0.05), 5kPa即牵张力对兔鼻软骨细胞增殖活性的调控影响明显,兔鼻软骨细胞增殖活性变化与牵张力作用时间有关。5kPa牵张应力实验组中兔鼻软骨细胞的增殖高峰在10h处,12h处增殖活性明显降低,即不同的作用时间对兔鼻软骨细胞周期具有不同的调节效应,持续牵张应力在一定时间范围内可以促进兔鼻软骨细胞的增殖活性。这提示适当的牵张力刺激有利于改善细胞功能和活性,但长期较大的牵张力刺激可能引起细胞损伤,反而阻碍软骨细胞分化增殖,抑制细胞的活力。因此我们在临床应用鼻软骨牵张术前正畸矫治鼻畸形时应选用适当的牵张力作用时间,时间过长的牵张力反而有可能不利于兔鼻软骨的延长和软骨量的增加。有关适宜强度的牵张力周期及长期作用对软骨细胞的影响效果有待进一步研究。
3.3 体外培养不同年龄的兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下的增殖活性变化及其临床意义:1984年,Matsuo[1]等报道,耳廓软骨畸形患儿在出生后立即行软骨牵张矫治,可使耳软骨的面积和体积增加,获得了良好远期效果。Matsuo认为,在围产期阶段,母亲体内雌激素含量上升,相应导致胎儿细胞内透明质酸含量增加,透明质酸通过破坏细胞间质成份降低软骨,韧带和相关组织的弹性程度,使其柔软而容易塑形。而出生6周后婴儿体内雌激素水平开始下降,软骨变得富有弹性而不易塑形。因此认为唇腭裂伴发鼻畸形的牵张矫治应在出生后立即进行。20世纪90年代,在Matsuo研究基础上,Cuting,Grayson,Maull[2-4]等报道唇裂鼻一期修复术前应用牙槽突复位鼻畸形矫治器(Nasoalveolar Molding Plate,NAM)牵张鼻软骨,采用非手术鼻软骨牵张方法矫治唇腭裂伴发鼻畸形取得了良好效果(牵张装置示意图见图3、4)。本研究从体外细胞培养角度验证了鼻软骨牵张术前正畸方法矫治唇腭裂伴发鼻畸形的可行性。本研究结果表明:5kPa牵张力对不同年龄兔鼻软骨细胞的增殖活性变化的影响不同,牵张力对新生兔体外培养兔鼻软骨细胞的促增殖作用更为显著。我们推测可能是由于新生兔兔鼻软骨细胞较6周龄兔兔鼻软骨细胞在牵张力刺激下产生的具有促进细胞增殖作用的细胞因子的能力更强,所以对牵张力等刺激因素更为敏感有关,其机制尚需进一步深入研究。
本研究结果还表明,牵张力无论是对新生兔还是6周龄兔体外培养兔鼻软骨细胞均有促增殖作用 ......
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