雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析(1)
[摘要]根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1，TwGPPS2 全长cDNA，并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp，编码425个氨基酸蛋白，预测蛋白等电点为668，相对分子质量为47189 kDa；TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp，编码422个氨基酸蛋白，预测蛋白等电点为671，相对分子质量为46774 kDa；进一步构建了原核重组表达载体pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2，并成功诱导出TwGPPS1，TwGPPS2重组蛋白，为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。
[关键词]雷公藤； 牻牛儿基焦磷酸合酶； 克隆； 生物信息学分析； 蛋白表达
Cloning and protein expression analysis of geranyl diphosphate synthase
, 百拇医药
genes in Tripterygium wilfordii
TU Lichan1 ， ZHANG Yifeng1，2， SU Ping1，2， HU Tianyuan1， TONG Yuru1，2， GUAN Hongyu 1，2，ZHAO Yujun2， ZHANG Xianan1， YUAN Yuan2*， GAO Wei1*， HUANG Luqi2
( 1School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China)
, 百拇医药
[Abstract]Based on the transcriptome data， the study cloned fulllength cDNA of TwGPPS1 and TwGPPS2 genes from Tripterygium wilfordii suspension cells and then analyzed the bioinformation of the sequence and protein expression The cloned TwGPPS1 has a 1 278 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 425 amino acids The deduced isoelectric point (pI) was 668， a calculated molecular weight was about 47189 kDa. The fulllength cDNA of the TwGPPS2 contains a 1 269 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 422 amino acids The deduced isoelectric point (pI) was 671， a calculated molecular weight was about 46774 kDaThe entire reading frame of TwGPPS1，2 was cloned into the pET32a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3) cells to obtain the TwGPPS protein， which laid a basis for further study on the regulation of terpenoid secondary metabolism and biological synthesis.
, http://www.100md.com
[Key words]Tripterygium wilfordii； geranyl diphosphate synthase； cloning； bioinformatics analysis； protein expression
雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f為卫矛科雷公藤属木质藤本植物。作为一种传统中药，其味辛、苦，性寒，化学成分复杂，具有祛风除湿、消肿活血、通络止痛、解毒杀虫的功效，被广泛用于治疗肾小球肾炎、红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病及多种皮肤病，同时雷公藤也可作为农药用以杀虫、毒鼠、灭螺等，是目前国内外研究的热点天然药物之一[12]。现雷公藤已分离出200多种单体化合物，其中，具有生物活性的主要是倍半萜类(包括倍半萜生物碱类)、二萜类、及三萜类等化合物[3]。萜类作为其主要的活性成分，在植物中的含量较低，且由于雷公藤的过度开发利用，导致资源面临枯竭[45]。
萜类共同前体异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)来源于胞质内的MVA(mevalonate)途径与质体内的MEP(2CmethylDerythritol4phosphate)途径。雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase， GPPS)属于短链异戊烯基合酶家族成员，可以催化1分子的IPP和1分子DMAPP缩合形成牻牛儿基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)，为单萜提供碳骨架。目前已从滇龙胆[6]、薄荷[78]、长春花[9]、金鱼草[10]等植物中成功克隆得到。本研究克隆得到雷公藤萜类生物合成的关键酶基因TwGPPS1，TwGPPS2基因全长序列，为研究该基因功能以及探讨雷公藤萜类次生代谢调控提供靶基因。, 百拇医药(屠李婵 张逸风 苏平 胡添源 童宇茹 关红雨 赵瑜君 张夏楠 袁媛 高伟 黄璐琦)
[关键词]雷公藤； 牻牛儿基焦磷酸合酶； 克隆； 生物信息学分析； 蛋白表达
Cloning and protein expression analysis of geranyl diphosphate synthase
, 百拇医药
genes in Tripterygium wilfordii
TU Lichan1 ， ZHANG Yifeng1，2， SU Ping1，2， HU Tianyuan1， TONG Yuru1，2， GUAN Hongyu 1，2，ZHAO Yujun2， ZHANG Xianan1， YUAN Yuan2*， GAO Wei1*， HUANG Luqi2
( 1School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China)
, 百拇医药
[Abstract]Based on the transcriptome data， the study cloned fulllength cDNA of TwGPPS1 and TwGPPS2 genes from Tripterygium wilfordii suspension cells and then analyzed the bioinformation of the sequence and protein expression The cloned TwGPPS1 has a 1 278 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 425 amino acids The deduced isoelectric point (pI) was 668， a calculated molecular weight was about 47189 kDa. The fulllength cDNA of the TwGPPS2 contains a 1 269 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 422 amino acids The deduced isoelectric point (pI) was 671， a calculated molecular weight was about 46774 kDaThe entire reading frame of TwGPPS1，2 was cloned into the pET32a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3) cells to obtain the TwGPPS protein， which laid a basis for further study on the regulation of terpenoid secondary metabolism and biological synthesis.
, http://www.100md.com
[Key words]Tripterygium wilfordii； geranyl diphosphate synthase； cloning； bioinformatics analysis； protein expression
雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f為卫矛科雷公藤属木质藤本植物。作为一种传统中药，其味辛、苦，性寒，化学成分复杂，具有祛风除湿、消肿活血、通络止痛、解毒杀虫的功效，被广泛用于治疗肾小球肾炎、红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病及多种皮肤病，同时雷公藤也可作为农药用以杀虫、毒鼠、灭螺等，是目前国内外研究的热点天然药物之一[12]。现雷公藤已分离出200多种单体化合物，其中，具有生物活性的主要是倍半萜类(包括倍半萜生物碱类)、二萜类、及三萜类等化合物[3]。萜类作为其主要的活性成分，在植物中的含量较低，且由于雷公藤的过度开发利用，导致资源面临枯竭[45]。
萜类共同前体异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)来源于胞质内的MVA(mevalonate)途径与质体内的MEP(2CmethylDerythritol4phosphate)途径。雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase， GPPS)属于短链异戊烯基合酶家族成员，可以催化1分子的IPP和1分子DMAPP缩合形成牻牛儿基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)，为单萜提供碳骨架。目前已从滇龙胆[6]、薄荷[78]、长春花[9]、金鱼草[10]等植物中成功克隆得到。本研究克隆得到雷公藤萜类生物合成的关键酶基因TwGPPS1，TwGPPS2基因全长序列，为研究该基因功能以及探讨雷公藤萜类次生代谢调控提供靶基因。, 百拇医药(屠李婵 张逸风 苏平 胡添源 童宇茹 关红雨 赵瑜君 张夏楠 袁媛 高伟 黄璐琦)