基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别(1)
[摘要]高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术，在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景。文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别，利用COⅠ序列，在退火温度为60 ℃，45个循环数的条件下，建立正品鹿茸药材熔解曲线模型，并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围。结果表明，鹿茸药材在模板DNA质量浓度为 10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1，Mg2+浓度2.0 mmol·L-1的条件下，梅花鹿熔解曲线为双峰，其Tm分别为(81.96±0.07)，(84.51±0.03) ℃;马鹿熔解曲线为双峰，其Tm为(82.58±0.13)，(85.95±0.05) ℃。该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定。
[关键词]高分辨熔解曲线;鹿茸药材;分子鉴定
Molecular identification of hairy antler by analysis of high resolution melting
, http://www.100md.com
CHEN Kang1，2， JIANG Chao1， YUAN Yuan1*， HUANG Lu-qi1， JIN Yan1
(1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;
2. Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China)
[Abstract]High resolution melting (HRM)， an important technology for genotyping and mutation scanning， has broad prospects in the authenticity of traditional Chinese medicine. This paper selected universal COⅠ primers and used HRM to establish a new method for authenticity of Hairy Antler. PCR was conducted at the annealing temperature of 60 ℃ and 45 cycles. The range of the DNA template concentration， the primer concentration and the Mg2+ ion concentration were further optimized. The results showed that the Tm values of Cervus nippon were (81.96±0.07)，(84.51±0.03) ℃ and Cervus elaphus was(82.58±0.13)，(85.95±0.05) ℃ with 10-100 mg·L-1 DNA template， 0.2 μmol·L-1 primer， 2.0 mmol·L-1 Mg2+. This method can authenticate of hairy antler and is simple， fast， high-throughput， visualization.
, 百拇医药
[Key words]high resolution melting; hairy antler; molecular identification
doi：10.4268/cjcmm20150409
鹿茸始载于《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，能够提高机体工作能力、减轻疲劳，改善睡眠、饮食及蛋白质代谢障碍，增加肾脏利尿功能[1]。鹿茸正品为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿C. elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。作为名贵中药材品种，鹿茸在市场上供不应求且价格昂贵，导致市售饮片常出现各种混伪品，如驯鹿、白唇鹿、水鹿等常见动物的幼角饮片。赵磊等对梅花鹿茸、马鹿茸、花马杂交鹿茸、麋鹿茸及驯鹿茸等5种鹿茸的常规成分、无机元素和氨基酸含量进行了测定，结果表明梅花鹿茸、麋鹿茸与其他3种鹿茸无机元素存在差异[2]。因此，鹿茸真伪鉴别方法的开发对于保证药材品质具有重要的作用。
, 百拇医药
现代化学分析技术是一种常用的鹿茸品种鉴定和质量评价方法[3]，王树春等建立了中药材鹿茸(花鹿茸)的X衍射Fourier谱分析[4]，张丽等通过应用粉末X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定法对3支马鹿茸和1支花鹿茸中药材进行分析鉴定，并获得了马鹿茸的对照X射线衍射Fourier指纹图谱及特征标记峰值[5]。但化学成分积累往往受到多种因素的影响，导致鉴别图谱稳定性不高、背景较复杂[6]。
分子标记技术由于具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低等特点，已广泛用于中药鉴定领域[7]。张蓉等利用鹿茸动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物，通过PCR扩增、序列分析、构建系统进化树等步骤建立了鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法[8]，但该方法操作比较复杂、耗时长。王学勇等根据鹿科鹿属种动物Cytb序列建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法[9]，但其主要基于已知真伪品的DNA变异设计鉴别标记、建立鉴别方法，但对于未知伪品仍难以实现有效的鉴别。, 百拇医药(陈康 蒋超 袁媛 黄璐琦 金艳)
[关键词]高分辨熔解曲线;鹿茸药材;分子鉴定
Molecular identification of hairy antler by analysis of high resolution melting
, http://www.100md.com
CHEN Kang1，2， JIANG Chao1， YUAN Yuan1*， HUANG Lu-qi1， JIN Yan1
(1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;
2. Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China)
[Abstract]High resolution melting (HRM)， an important technology for genotyping and mutation scanning， has broad prospects in the authenticity of traditional Chinese medicine. This paper selected universal COⅠ primers and used HRM to establish a new method for authenticity of Hairy Antler. PCR was conducted at the annealing temperature of 60 ℃ and 45 cycles. The range of the DNA template concentration， the primer concentration and the Mg2+ ion concentration were further optimized. The results showed that the Tm values of Cervus nippon were (81.96±0.07)，(84.51±0.03) ℃ and Cervus elaphus was(82.58±0.13)，(85.95±0.05) ℃ with 10-100 mg·L-1 DNA template， 0.2 μmol·L-1 primer， 2.0 mmol·L-1 Mg2+. This method can authenticate of hairy antler and is simple， fast， high-throughput， visualization.
, 百拇医药
[Key words]high resolution melting; hairy antler; molecular identification
doi：10.4268/cjcmm20150409
鹿茸始载于《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，能够提高机体工作能力、减轻疲劳，改善睡眠、饮食及蛋白质代谢障碍，增加肾脏利尿功能[1]。鹿茸正品为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿C. elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。作为名贵中药材品种，鹿茸在市场上供不应求且价格昂贵，导致市售饮片常出现各种混伪品，如驯鹿、白唇鹿、水鹿等常见动物的幼角饮片。赵磊等对梅花鹿茸、马鹿茸、花马杂交鹿茸、麋鹿茸及驯鹿茸等5种鹿茸的常规成分、无机元素和氨基酸含量进行了测定，结果表明梅花鹿茸、麋鹿茸与其他3种鹿茸无机元素存在差异[2]。因此，鹿茸真伪鉴别方法的开发对于保证药材品质具有重要的作用。
, 百拇医药
现代化学分析技术是一种常用的鹿茸品种鉴定和质量评价方法[3]，王树春等建立了中药材鹿茸(花鹿茸)的X衍射Fourier谱分析[4]，张丽等通过应用粉末X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定法对3支马鹿茸和1支花鹿茸中药材进行分析鉴定，并获得了马鹿茸的对照X射线衍射Fourier指纹图谱及特征标记峰值[5]。但化学成分积累往往受到多种因素的影响，导致鉴别图谱稳定性不高、背景较复杂[6]。
分子标记技术由于具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低等特点，已广泛用于中药鉴定领域[7]。张蓉等利用鹿茸动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物，通过PCR扩增、序列分析、构建系统进化树等步骤建立了鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法[8]，但该方法操作比较复杂、耗时长。王学勇等根据鹿科鹿属种动物Cytb序列建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法[9]，但其主要基于已知真伪品的DNA变异设计鉴别标记、建立鉴别方法，但对于未知伪品仍难以实现有效的鉴别。, 百拇医药(陈康 蒋超 袁媛 黄璐琦 金艳)