响应面法优化超声辅助法提取昆仑雪菊色素的工艺研究(1)
[摘要] 以昆仑雪菊干燥头状花序为试验材料，利用响应面法优化超声辅助提取昆仑雪菊色素的条件，分别考察提取温度、超声时间、液料比及溶剂浓度对提取效率的影响。实验表明昆仑雪菊色素以黄酮类成分为主，色素提取液在紫外-可见光区最大吸收波长为380 nm。在单因素实验基础上，进行4因素3水平的响应面分析实验，优化条件为提取温度70 ℃、超声时间60 min、液料比32.05∶1 mL·g-1、溶剂浓度为72.25%的乙醇，在此条件下昆仑雪菊色素提取液的吸光度为0.936，与模型预测值接近，方程拟合良好，适于对昆仑雪菊色素提取工艺进行回归分析和参数优化。
[关键词] 昆仑雪菊;超声波;响应面设计法;色素
[收稿日期] 2014-09-01
[通信作者] 郭巧生，Tel/Fax： (025)84395980，E-mail：gqs@njau.edu.cn;李维林，Tel/Fax：(025)84347002，E-mail：lwlcnb@mail.cnbg.net
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双色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.属于菊科金鸡菊属，原产于美国中西部地区，目前在我国新疆部分地区大面积栽培，干燥头状花序入药，称为昆仑雪菊，冲泡后茶汤呈绛红色，维吾尔语“古丽恰尔”[1-3]。昆仑雪菊具“破血疏肝，解疔散毒”，作为茶饮亦可清热解毒、降脂降压[4] 。昆仑雪菊舌状花瓣鲜艳肥厚，管状花瓣色深适合提取无毒副作用，甚至具有药理保健功效的天然色素[5-7]。
响应面法自20世纪70年代应用于食品药品工业以来[8]，常被应用于确定食品药品中各成分作用和各成分所占比例、利用响应面设计法(RSM)优化反应条件[9]，响应面设计法是可靠的实验设计以及分析方法，因此本实验采用该方法优化昆仑雪菊色素提取工艺，为将来昆仑雪菊深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
昆仑雪菊采自新疆维吾尔自治区昌吉市，经南京农业大学郭巧生教授鉴定为菊科植物两色金鸡菊C. tinctoria 的头状花序。95%乙醇(化学纯)购于南京化学试剂有限公司。
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1.2 仪器与设备
FZ-102型植物粉碎机(武汉格莱莫检测设备有限公司);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司);KQ250B型超声仪(昆山市超声仪器公司);FA1104(1/1万，上海精科天平);756CRT型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 超声波辅助提取昆仑雪菊色素工艺流程 昆仑雪菊干燥头状花序，粉碎，过60目筛，超声波辅助浸提，抽滤即得色素样品。
1.3.2 色素提取液吸收波长及稀释倍数的确定 天然色素提取物中存在大量非色素成分，中国食品添加剂标准规定用吸光度表示[10]。取0.25 g干燥雪菊药材粉末，30 mL 70%乙醇超声提取45 min后抽滤，取1 mL提取液分别稀释至0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6单位浓度，在300～600 nm波段扫描确定色素提取液的最大吸收波长[11]。
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1.3.3 超声辅助提取法与传统浸提法提取效果的比较 准确称取0.10 g昆仑雪菊粉末，以70%乙醇为提取溶剂，分别采用传统浸提法和超声辅助法进行色素提取。考察昆仑雪菊在不同提取方法条件下色素提取效率的差异[12]。
1.3.4 超声辅助提取昆仑雪菊色素单因素试验 准确称取0.10 g昆仑雪菊粉末，以70%乙醇为提取溶剂。考察不同超声波水浴温度(40，50，60，70，80 ℃)、超声波处理时间(15，30，45，60，75 min)、液料比(20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL·g-1)及浸提剂浓度(50%，60%，70%， 80%，95%)对提取效率的影响。
1.3.5 响应面优化超声辅助提取昆仑雪菊色素试验 在单因素实验基础上，采用响应面法中Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以吸光度为响应值，通过响应曲面分析进行提取条件的优化，并运用Design-Expert 8.0 软件设计并分析得到最优提取条件。
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2 结果与分析
2.1 昆仑雪菊色素提取液波段扫描图
采用超声波辅助提取法，在70 ℃、液料比30∶1 mL·g-1的条件下，昆仑雪菊色素提取液在380 nm处有最大吸收峰，同时采用传统浸提法提取昆仑雪菊色素提取液在380 nm处也有显著吸收峰，因此380 nm为雪菊色素提取液的最大吸收波长(图1)，本实验在测定提取液吸光度时，应在此波长条件下进行。单位浓度为0.2时的读数在0～1，此稀释倍数最佳。稳定性实验表明(2，4，8，16，24，48 h)，雪菊色素提取液稳定性良好，RSD 1.1%。
2.2 超声辅助提取法与传统浸提法提取效果的比较
超声辅助法提取效果在速率和效率都优于传统浸提法，随着提取时间的增加吸光度下降(图2)，可能由于提取时间过长造成溶液中杂质含量增加，最终影响提取效率。
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2.3 超声辅助提取昆仑雪菊色素单因素试验
2.3.1 提取温度对提取效果的影响 按1.3.4项下方法，选择提取温度分别为40，50，60，70，80 ℃进行比较。总体分析而言随着温度升高，昆仑雪菊色素提取率的变化呈现出相关性，当温度超过70 ℃，提取液吸光度下降明显(图3)。故从高温对色素的提取所带来的有效成分易被破坏、溶剂易挥发等方面考虑，选择温度为70 ℃。
2.3.2 超声时间对提取效果的影响 提取温度70 ℃，其他条件不变，选择超声时间分别为15，30，45，60，75 min进行比较。随着超声时间的增加，昆仑雪菊色素提取率亦呈现相关性，当超声时间为60 min时，昆仑雪菊色素提取液吸光度达到峰值，溶出的色素随着时间和光照的增加而发生氧化降解，从而降低色素的含量[13](图4)。为得到最佳实验条件，选择超声处理时间为60 min。, http://www.100md.com(徐璐 汪涛 郭巧生 李维林)
[关键词] 昆仑雪菊;超声波;响应面设计法;色素
[收稿日期] 2014-09-01
[通信作者] 郭巧生，Tel/Fax： (025)84395980，E-mail：gqs@njau.edu.cn;李维林，Tel/Fax：(025)84347002，E-mail：lwlcnb@mail.cnbg.net
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双色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.属于菊科金鸡菊属，原产于美国中西部地区，目前在我国新疆部分地区大面积栽培，干燥头状花序入药，称为昆仑雪菊，冲泡后茶汤呈绛红色，维吾尔语“古丽恰尔”[1-3]。昆仑雪菊具“破血疏肝，解疔散毒”，作为茶饮亦可清热解毒、降脂降压[4] 。昆仑雪菊舌状花瓣鲜艳肥厚，管状花瓣色深适合提取无毒副作用，甚至具有药理保健功效的天然色素[5-7]。
响应面法自20世纪70年代应用于食品药品工业以来[8]，常被应用于确定食品药品中各成分作用和各成分所占比例、利用响应面设计法(RSM)优化反应条件[9]，响应面设计法是可靠的实验设计以及分析方法，因此本实验采用该方法优化昆仑雪菊色素提取工艺，为将来昆仑雪菊深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
昆仑雪菊采自新疆维吾尔自治区昌吉市，经南京农业大学郭巧生教授鉴定为菊科植物两色金鸡菊C. tinctoria 的头状花序。95%乙醇(化学纯)购于南京化学试剂有限公司。
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1.2 仪器与设备
FZ-102型植物粉碎机(武汉格莱莫检测设备有限公司);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司);KQ250B型超声仪(昆山市超声仪器公司);FA1104(1/1万，上海精科天平);756CRT型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 超声波辅助提取昆仑雪菊色素工艺流程 昆仑雪菊干燥头状花序，粉碎，过60目筛，超声波辅助浸提，抽滤即得色素样品。
1.3.2 色素提取液吸收波长及稀释倍数的确定 天然色素提取物中存在大量非色素成分，中国食品添加剂标准规定用吸光度表示[10]。取0.25 g干燥雪菊药材粉末，30 mL 70%乙醇超声提取45 min后抽滤，取1 mL提取液分别稀释至0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6单位浓度，在300～600 nm波段扫描确定色素提取液的最大吸收波长[11]。
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1.3.3 超声辅助提取法与传统浸提法提取效果的比较 准确称取0.10 g昆仑雪菊粉末，以70%乙醇为提取溶剂，分别采用传统浸提法和超声辅助法进行色素提取。考察昆仑雪菊在不同提取方法条件下色素提取效率的差异[12]。
1.3.4 超声辅助提取昆仑雪菊色素单因素试验 准确称取0.10 g昆仑雪菊粉末，以70%乙醇为提取溶剂。考察不同超声波水浴温度(40，50，60，70，80 ℃)、超声波处理时间(15，30，45，60，75 min)、液料比(20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 mL·g-1)及浸提剂浓度(50%，60%，70%， 80%，95%)对提取效率的影响。
1.3.5 响应面优化超声辅助提取昆仑雪菊色素试验 在单因素实验基础上，采用响应面法中Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以吸光度为响应值，通过响应曲面分析进行提取条件的优化，并运用Design-Expert 8.0 软件设计并分析得到最优提取条件。
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2 结果与分析
2.1 昆仑雪菊色素提取液波段扫描图
采用超声波辅助提取法，在70 ℃、液料比30∶1 mL·g-1的条件下，昆仑雪菊色素提取液在380 nm处有最大吸收峰，同时采用传统浸提法提取昆仑雪菊色素提取液在380 nm处也有显著吸收峰，因此380 nm为雪菊色素提取液的最大吸收波长(图1)，本实验在测定提取液吸光度时，应在此波长条件下进行。单位浓度为0.2时的读数在0～1，此稀释倍数最佳。稳定性实验表明(2，4，8，16，24，48 h)，雪菊色素提取液稳定性良好，RSD 1.1%。
2.2 超声辅助提取法与传统浸提法提取效果的比较
超声辅助法提取效果在速率和效率都优于传统浸提法，随着提取时间的增加吸光度下降(图2)，可能由于提取时间过长造成溶液中杂质含量增加，最终影响提取效率。
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2.3 超声辅助提取昆仑雪菊色素单因素试验
2.3.1 提取温度对提取效果的影响 按1.3.4项下方法，选择提取温度分别为40，50，60，70，80 ℃进行比较。总体分析而言随着温度升高，昆仑雪菊色素提取率的变化呈现出相关性，当温度超过70 ℃，提取液吸光度下降明显(图3)。故从高温对色素的提取所带来的有效成分易被破坏、溶剂易挥发等方面考虑，选择温度为70 ℃。
2.3.2 超声时间对提取效果的影响 提取温度70 ℃，其他条件不变，选择超声时间分别为15，30，45，60，75 min进行比较。随着超声时间的增加，昆仑雪菊色素提取率亦呈现相关性，当超声时间为60 min时，昆仑雪菊色素提取液吸光度达到峰值，溶出的色素随着时间和光照的增加而发生氧化降解，从而降低色素的含量[13](图4)。为得到最佳实验条件，选择超声处理时间为60 min。, http://www.100md.com(徐璐 汪涛 郭巧生 李维林)