不同条件下连作杭白菊内生菌群的T—RFLP分析(1)
[摘要] 通过研究轮作以及有机肥处理对连作杭白菊各器官内生细菌多样性和优势菌属的影响，揭示轮作和有机肥在缓解杭白菊连作障碍中的作用，筛选能够增强连作白菊抗病能力的有益内生菌。实验共设4个处理组，分别为连作处理、轮作处理、连作后施自制蚕沙发酵有机肥处理以及连作后施市售菌肥处理，通过基于16S rDNA的末端标记限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism， T-RFLP)分析这些处理对杭白菊各器官内生细菌多样性及优势菌属的影响。结果显示，HaeⅢ内切酶能产生更多的TRFs数，比HinfI酶更适合用来分析杭白菊内生菌多样性。有机肥和菌肥处理组的内生菌Simpson指数与轮作组相近，均高于连作，说明土壤外源微生物的添加导致植物内生菌多样性提高。实验共筛选出18种优势菌属，包括3种厚壁菌、4种放线菌和11种变形菌，其中节杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属和分支杆菌属等优势菌属均在轮作组和菌肥组中检测到，而连作组中缺乏，说明添加外源微生物与轮作处理对杭白菊的内生菌群的影响基本类似，同时也说明这些菌的增加可能会通过影响连作白术的生长来缓解连作障碍。此外，比较不同器官中的内生菌的多样性及优势菌数量发现，根中最高，茎次之，叶中最少，这与内生菌侵入植株方式有关。总之，连作导致杭白菊内生细菌多样性降低，而轮作和菌肥处理后均能通过增加土壤微生物的多样性水平从而使连作杭白菊内生细菌多样性提高，最终达到缓解白菊连作障碍的目的。
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[关键词] 杭白菊;内生细菌;连作障碍;T-RFLP;益生菌
[收稿日期] 2014-06-30
[基金项目] 第53批中国博士后科学基金项目(2013M531484);浙江省博士后科研项目(BSH1301033);浙江省公益研究项目(2014C32106)
[通信作者] 袁小凤，博士，副教授，研究方向为药用植物资源保护与利用，E-mail： 13184220300@163.com
杭白菊Chrysanthemum morifolium，多年生草本植物，为菊科植物菊的干燥头状花序，历史上曾享有“杭白菊与龙井茶”并提之誉，是中国传统著名出口中药材“浙八味”之一，具有很高的营养价值和药用功效[1-2]。长期以来，对杭白菊的研究主要集中在有效成份的提取、含量测定、有效成分的药理活性等方面，并已取得很大进展。近年来，随着临床需求的不断扩大，杭白菊的种植规模也随之扩大，然而菊农在杭白菊的种植中发现其存在连作障碍，严重影响经济效益。随着科学的进步，对缓解作物连作障碍的研究也日渐深入，目前大多集中在土壤理化性质的改变和土壤微生物方面，缺乏从内生菌角度的研究，虽然现已有很多研究证明绝大多数植物中都存在内生菌，但涉及杭白菊内生细菌的研究却知之甚少。
, 百拇医药
植物内生细菌是栖息在健康植物组织内且对宿主无实质性伤害的一类微生物，其中一些细菌对植物有益，具有促进植物种子萌发和光合形态建成及生长发育，增强宿主抗逆性等生物学功能[3-4]。内生菌与其宿主的关系紧密相关，它不仅能够通过拮抗作用、竞争、诱导抗性等方式来增强植物自身的防御机制，以避免微生物的侵害[5]，在缓解连作障碍中起着重要的作用，还能促进和诱导药材有效成分的合成与累积，影响药材的药效和道地性[6]。因此，分离并开发利用植物内生菌资源，对研究植物与内生菌的相互关系具有重要的理论意义和实用价值。
对于连作障碍的防治，目前从轮作、施肥及化学方法方面研究较多，但农药和化学肥料的大量使用易造成新的环境问题和食物品质问题[7]。随着全球对生态环境的日益重视和社会对农业可持续发展的要求，生物菌肥由于不污染环境、还能解决土壤农药残留问题等开始得到重视[8-9]。研究表明，添加外源微生物能改变根际菌群结构，从而达到有效缓解连作障碍、提高作物产量的目的，这在大豆，豇豆，绿豆及草莓等作物中已经得到证实[10-12]。前期工作中对连作杭白菊施用自制蚕沙肥发现能有效缓解连作障碍，根际微生物发生了明显改变，只是尚不清楚其对内生菌的影响如何。本研究以杭白菊为研究对象，探讨连作、轮作和菌肥处理对杭白菊不同器官内生菌多样性及优势菌属的影响，旨在为缓解杭白菊连作障碍提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 样品采集和处理
野外试验地设在淳安县枫树岭。实验田设4组：轮作对照组(杭白菊与蔬菜轮作)、连作对照组(杭白菊连作3年)、蚕沙有机肥组(将蚕沙、无机肥与土壤按比例混合发酵后，对连作3年杭白菊的施用量为0.3 kg·m-2)、市售菌肥组(菌肥的商品名为三炬灌金液，其成分为微生物芽孢菌，对连作3年杭白菊的施用量为0.3 kg·m-2)。每组3个小区(重复)，每个小区面积2 m×5 m，共有12个小区，由专人统一管理和采样。采样时间为2013年11月19日下午14：00左右用五点取样法[13]采集各组的根、茎、叶，用清水清洗干净，分装入收集管，置于冰盒中迅速带回实验室。然后按如下过程进行表面消毒[14]：将根、茎、叶依次用70%乙醇浸泡2，2，3 min;无菌水冲洗3次;再用2%次氯酸钠分别浸泡6，6，8 min，无菌水清洗2次，用无菌滤纸吸干表面水分，放入-80 ℃冰箱备用。
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1.2 总基因组DNA的提取
采用AxyPrep DNA 提取试剂盒分别提取杭白菊根、茎、叶总DNA，具体步骤依照试剂盒说明书进行。
1.3 内生细菌16S rDNA的PCR扩增
将提取得到的基因组DNA作为模板，使用Ependorf的PCRsystem2700型基因扩增仪，采用对大多数内生细菌16S rDNA基因的V3区具有特异性的引物对8f-FAM和518r，扩增产物大小约500 bp[15]。16S rDNA的PCR反应体系(50 μL)包括20～50 ng的DNA模板2 μL、引物(8f-FAM和518r)溶液(10 μmol·L-1)各1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，10×PCR buffer(带MgCl2)5 μL，Taq酶0.4 μL(2.5 U·μL-1)，最后无菌水补足50 μL。采用普通PCR策略：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性20 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s(重复30个循环);最后再72 ℃延伸7 min[16]。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行割胶回收，以8f-FAM和518r为引物进行PCR重扩增，扩增产物用DNA凝胶清洁纯化试剂盒纯化。, 百拇医药(彭三妹 王博林 徐建中 丁志山 袁小凤)
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[关键词] 杭白菊;内生细菌;连作障碍;T-RFLP;益生菌
[收稿日期] 2014-06-30
[基金项目] 第53批中国博士后科学基金项目(2013M531484);浙江省博士后科研项目(BSH1301033);浙江省公益研究项目(2014C32106)
[通信作者] 袁小凤，博士，副教授，研究方向为药用植物资源保护与利用，E-mail： 13184220300@163.com
杭白菊Chrysanthemum morifolium，多年生草本植物，为菊科植物菊的干燥头状花序，历史上曾享有“杭白菊与龙井茶”并提之誉，是中国传统著名出口中药材“浙八味”之一，具有很高的营养价值和药用功效[1-2]。长期以来，对杭白菊的研究主要集中在有效成份的提取、含量测定、有效成分的药理活性等方面，并已取得很大进展。近年来，随着临床需求的不断扩大，杭白菊的种植规模也随之扩大，然而菊农在杭白菊的种植中发现其存在连作障碍，严重影响经济效益。随着科学的进步，对缓解作物连作障碍的研究也日渐深入，目前大多集中在土壤理化性质的改变和土壤微生物方面，缺乏从内生菌角度的研究，虽然现已有很多研究证明绝大多数植物中都存在内生菌，但涉及杭白菊内生细菌的研究却知之甚少。
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植物内生细菌是栖息在健康植物组织内且对宿主无实质性伤害的一类微生物，其中一些细菌对植物有益，具有促进植物种子萌发和光合形态建成及生长发育，增强宿主抗逆性等生物学功能[3-4]。内生菌与其宿主的关系紧密相关，它不仅能够通过拮抗作用、竞争、诱导抗性等方式来增强植物自身的防御机制，以避免微生物的侵害[5]，在缓解连作障碍中起着重要的作用，还能促进和诱导药材有效成分的合成与累积，影响药材的药效和道地性[6]。因此，分离并开发利用植物内生菌资源，对研究植物与内生菌的相互关系具有重要的理论意义和实用价值。
对于连作障碍的防治，目前从轮作、施肥及化学方法方面研究较多，但农药和化学肥料的大量使用易造成新的环境问题和食物品质问题[7]。随着全球对生态环境的日益重视和社会对农业可持续发展的要求，生物菌肥由于不污染环境、还能解决土壤农药残留问题等开始得到重视[8-9]。研究表明，添加外源微生物能改变根际菌群结构，从而达到有效缓解连作障碍、提高作物产量的目的，这在大豆，豇豆，绿豆及草莓等作物中已经得到证实[10-12]。前期工作中对连作杭白菊施用自制蚕沙肥发现能有效缓解连作障碍，根际微生物发生了明显改变，只是尚不清楚其对内生菌的影响如何。本研究以杭白菊为研究对象，探讨连作、轮作和菌肥处理对杭白菊不同器官内生菌多样性及优势菌属的影响，旨在为缓解杭白菊连作障碍提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 样品采集和处理
野外试验地设在淳安县枫树岭。实验田设4组：轮作对照组(杭白菊与蔬菜轮作)、连作对照组(杭白菊连作3年)、蚕沙有机肥组(将蚕沙、无机肥与土壤按比例混合发酵后，对连作3年杭白菊的施用量为0.3 kg·m-2)、市售菌肥组(菌肥的商品名为三炬灌金液，其成分为微生物芽孢菌，对连作3年杭白菊的施用量为0.3 kg·m-2)。每组3个小区(重复)，每个小区面积2 m×5 m，共有12个小区，由专人统一管理和采样。采样时间为2013年11月19日下午14：00左右用五点取样法[13]采集各组的根、茎、叶，用清水清洗干净，分装入收集管，置于冰盒中迅速带回实验室。然后按如下过程进行表面消毒[14]：将根、茎、叶依次用70%乙醇浸泡2，2，3 min;无菌水冲洗3次;再用2%次氯酸钠分别浸泡6，6，8 min，无菌水清洗2次，用无菌滤纸吸干表面水分，放入-80 ℃冰箱备用。
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1.2 总基因组DNA的提取
采用AxyPrep DNA 提取试剂盒分别提取杭白菊根、茎、叶总DNA，具体步骤依照试剂盒说明书进行。
1.3 内生细菌16S rDNA的PCR扩增
将提取得到的基因组DNA作为模板，使用Ependorf的PCRsystem2700型基因扩增仪，采用对大多数内生细菌16S rDNA基因的V3区具有特异性的引物对8f-FAM和518r，扩增产物大小约500 bp[15]。16S rDNA的PCR反应体系(50 μL)包括20～50 ng的DNA模板2 μL、引物(8f-FAM和518r)溶液(10 μmol·L-1)各1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，10×PCR buffer(带MgCl2)5 μL，Taq酶0.4 μL(2.5 U·μL-1)，最后无菌水补足50 μL。采用普通PCR策略：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性20 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s(重复30个循环);最后再72 ℃延伸7 min[16]。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行割胶回收，以8f-FAM和518r为引物进行PCR重扩增，扩增产物用DNA凝胶清洁纯化试剂盒纯化。, 百拇医药(彭三妹 王博林 徐建中 丁志山 袁小凤)