ge15菌株的鉴定及其对人参病害的防治效果(1)
[摘要] 根据以前的16S rDNA序列同源性分析结果，以及研究开展的生理生化指标测定及形态学观察结果，将从人参根中分离到细菌ge15菌株鉴定为嗜根寡养单胞菌Stenotrophomonas rhizophila。对峙培养发现，ge15菌株对人参黑斑病菌Alternaria panax、人参疫病菌Phytophthora cactorum和人参锈腐病菌Cylindrocapon destructans的抑菌效果明显，抑菌带宽分别为13.3，24.0，12.0 mm。试验结果表明，经ge15菌株处理的人参出苗率和存苗率与多菌灵相当，均显著高于对照。考虑到生防菌田间施用时无毒、无污染等优点，该菌株在人参病害防治过程中具有良好的应用潜力。
[关键词] 人参;细菌鉴定;病害;生物防治
[收稿日期] 2014-06-25
[基金项目] 中央公益性科研院所基金项目(2012D13);协和青年科学基金项目(3332013113)
, 百拇医药
[通信作者] 李勇，Tel：(010)57833360，E-mail：liyong@implad.ac.cn
[作者简介] 刘敏，硕士研究生，E-mail：liumin_89@126.com
人参是我国传统名贵中药材，连作障碍问题十分突出，其中的病害问题尤其严重，对人参产量及品质影响较大[1]。尽管依赖化学农药的传统方法对人参病害有较显著的防治效果，但使用不当易导致农药残留、环境污染等问题;另外，化学农药频繁使用还会导致病菌抗药性的产生。生物防治是解决药用植物病害问题的有效途径之一[2]。但是，现有生防菌(如木霉菌、芽孢杆菌等)均为土壤宿生型菌株，其种群定殖和保持易受外界环境因素影响，对植物病害的防治效果往往难以稳定发挥。内生型菌株由于生活在植物体内，生存环境相对稳定，将其应用于病害防治将有助于上述问题的解决。迄今，国内已有关于人参内生生防菌株的相关报道，邱服斌等[3]分离的人参内生细菌ge21对包括人参在内的多种植物病原真菌有抑制作用。姜竹[4]也从人参根部分离到了具有抑菌活性的内生细菌，并对其抑菌物质开展了研究。前期，笔者从人参根内分离到了1株对多种人参病原菌有拮抗活性的内生菌株ge15，并通过16S rDNA同源性分析对其进行了初步鉴定。本研究通过生理生化指标测定及显微形态特征观察，确定了该菌株的分类学地位;通过盆栽试验，比较了其与常规杀菌剂多菌灵对人参病害的防治效果，明确了其作为生防菌在人参病害防治上的应用潜力。
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1 材料与方法
1.1 供试样品 供试人参种子、种苗购自吉林省抚松县人参产区。
供试病原菌人参锈腐菌Cylindrocapon destructans、人参疫病菌Phytophthora cactorum、人参黑斑菌Alternaria panax，均由本课题组保存。
PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L，pH 7.0;LB培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
1.2 ge15菌株鉴定 将ge15菌株在LB培养基上划线，30 ℃培养24 h，观察菌落形态及电镜显微形态结构，对菌株的生理生化指标测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[5]。
, http://www.100md.com 1.3 ge15菌株培养特性研究 培养时间对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到LB液体培养基中，30 ℃，150 r·min-1振荡培养，接种后0，5，10，12，17，20，24，30，40，48，64 h取样，测定A600，绘制生长曲线。
温度对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到LB液体培养基中，分别在15，25，30，37，43 ℃，150 r·min-1振荡培养24 h，取样测定A600。
pH对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到pH 5，6，7，8，9的LB液体培养基中，30，150 r·min-1振荡培养24 h，取样测定A600[6]。
1.4 ge15菌株抑菌谱测定 采用对峙培养法[7]，对3种供试人参病原菌进行抑菌试验。将供试菌株制成直径9 mm菌饼，置于PDA平板一端，然后将ge15菌株划线接种于距供试病原菌菌饼40 mm处，25 ℃恒温培养5～7 d后测定病菌的菌落半径和抑菌带宽度，每个处理3次重复。
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1.5 ge15菌株对人参病害的防治效果 盆栽防病试验在北京协和医学院药用植物研究所人参荫棚开展，试验用土包括老参地土和新林土，均来自人参产区。将人参种子、种苗分别在1×108cfu·mL-1菌悬液中浸泡30 min，人参种子播种于直径15 cm花盆中，每盆播种10粒种子，用于出苗率测定;人参种苗移栽到直径25 cm花盆中，每盆10株，用于存苗率测定。另一组用50%多菌灵400倍稀释液浸泡人参种子、种苗。对照组用无菌水代替。每个处理的种子和种苗各10盆。
播种或移栽后，将所有花盆置于荫棚中培养，每隔10 d在人参苗根部浇灌1×108cfu·mL-1菌悬液，共浇灌3次;另一处理浇灌等量多菌灵稀释液，对照用等量无菌水代替。定期统计人参种子出苗率和种苗存活率。
出苗率=(出苗数/总播种数)×100%, 百拇医药(刘敏 丁万隆 高原 李勇)
[关键词] 人参;细菌鉴定;病害;生物防治
[收稿日期] 2014-06-25
[基金项目] 中央公益性科研院所基金项目(2012D13);协和青年科学基金项目(3332013113)
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[通信作者] 李勇，Tel：(010)57833360，E-mail：liyong@implad.ac.cn
[作者简介] 刘敏，硕士研究生，E-mail：liumin_89@126.com
人参是我国传统名贵中药材，连作障碍问题十分突出，其中的病害问题尤其严重，对人参产量及品质影响较大[1]。尽管依赖化学农药的传统方法对人参病害有较显著的防治效果，但使用不当易导致农药残留、环境污染等问题;另外，化学农药频繁使用还会导致病菌抗药性的产生。生物防治是解决药用植物病害问题的有效途径之一[2]。但是，现有生防菌(如木霉菌、芽孢杆菌等)均为土壤宿生型菌株，其种群定殖和保持易受外界环境因素影响，对植物病害的防治效果往往难以稳定发挥。内生型菌株由于生活在植物体内，生存环境相对稳定，将其应用于病害防治将有助于上述问题的解决。迄今，国内已有关于人参内生生防菌株的相关报道，邱服斌等[3]分离的人参内生细菌ge21对包括人参在内的多种植物病原真菌有抑制作用。姜竹[4]也从人参根部分离到了具有抑菌活性的内生细菌，并对其抑菌物质开展了研究。前期，笔者从人参根内分离到了1株对多种人参病原菌有拮抗活性的内生菌株ge15，并通过16S rDNA同源性分析对其进行了初步鉴定。本研究通过生理生化指标测定及显微形态特征观察，确定了该菌株的分类学地位;通过盆栽试验，比较了其与常规杀菌剂多菌灵对人参病害的防治效果，明确了其作为生防菌在人参病害防治上的应用潜力。
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1 材料与方法
1.1 供试样品 供试人参种子、种苗购自吉林省抚松县人参产区。
供试病原菌人参锈腐菌Cylindrocapon destructans、人参疫病菌Phytophthora cactorum、人参黑斑菌Alternaria panax，均由本课题组保存。
PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，蒸馏水1 L，pH 7.0;LB培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
1.2 ge15菌株鉴定 将ge15菌株在LB培养基上划线，30 ℃培养24 h，观察菌落形态及电镜显微形态结构，对菌株的生理生化指标测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[5]。
, http://www.100md.com 1.3 ge15菌株培养特性研究 培养时间对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到LB液体培养基中，30 ℃，150 r·min-1振荡培养，接种后0，5，10，12，17，20，24，30，40，48，64 h取样，测定A600，绘制生长曲线。
温度对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到LB液体培养基中，分别在15，25，30，37，43 ℃，150 r·min-1振荡培养24 h，取样测定A600。
pH对ge15菌株生长的影响：将ge15接种到pH 5，6，7，8，9的LB液体培养基中，30，150 r·min-1振荡培养24 h，取样测定A600[6]。
1.4 ge15菌株抑菌谱测定 采用对峙培养法[7]，对3种供试人参病原菌进行抑菌试验。将供试菌株制成直径9 mm菌饼，置于PDA平板一端，然后将ge15菌株划线接种于距供试病原菌菌饼40 mm处，25 ℃恒温培养5～7 d后测定病菌的菌落半径和抑菌带宽度，每个处理3次重复。
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1.5 ge15菌株对人参病害的防治效果 盆栽防病试验在北京协和医学院药用植物研究所人参荫棚开展，试验用土包括老参地土和新林土，均来自人参产区。将人参种子、种苗分别在1×108cfu·mL-1菌悬液中浸泡30 min，人参种子播种于直径15 cm花盆中，每盆播种10粒种子，用于出苗率测定;人参种苗移栽到直径25 cm花盆中，每盆10株，用于存苗率测定。另一组用50%多菌灵400倍稀释液浸泡人参种子、种苗。对照组用无菌水代替。每个处理的种子和种苗各10盆。
播种或移栽后，将所有花盆置于荫棚中培养，每隔10 d在人参苗根部浇灌1×108cfu·mL-1菌悬液，共浇灌3次;另一处理浇灌等量多菌灵稀释液，对照用等量无菌水代替。定期统计人参种子出苗率和种苗存活率。
出苗率=(出苗数/总播种数)×100%, 百拇医药(刘敏 丁万隆 高原 李勇)