基于转录组的新疆紫草ERF转录因子家族生物信息学分析(1)
[摘要] 从新疆紫草转录组分离出27个ERF转录因子家族基因，平均大小为1 010 bp，每个基因平均编码了212个氨基酸。以紫草ERF基因gi261363612为参考，对27AeERFS从基因结构、表达量、理化性质、亚细胞定位、信号肽、高级结构和保守域的预测和分析等方面做了研究，并对新疆紫草ERF家族做了系统进化分析，认为最合适的建树方法为最大似然法。结果显示，该家族存在3个保守域，高级结构以无规则卷曲为主，聚为CBF/DREB，ERF 2个亚族。
[关键词] ERF; 转录组;新疆紫草;生物信息学
[收稿日期] 2014-06-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81130070，81072989);国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)
[通信作者] 郭兰萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com
, 百拇医药
[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：txwsxtws@163.com
ERF转录因子家族是在植物中发现的一个转录因子大家族[1]，自从1995年克隆得到烟草的ERFs以来，发现ERF家族参与了植物生长、发育中的一系列生物学过程[1-3]，在植物应对旱[4]、盐[5]、冷[6]、热[7]等非生物胁迫和真菌、细菌等生物胁迫[8-9]中起着重要作用。此外，ERF转录因子家族作为赤霉素[10]、茉莉酸[11]、细胞分裂素[12]、水杨酸[13]、乙烯[14]、脱落酸[15]等信号通路交叉互作的连接因子[16-18]，是目前研究的热点之一，有巨大的研究价值。
根据ERF转录因子所结合的顺式作用元件，ERF转录因子家族分为2个大的亚家族：CBF/DREB亚家族和ERF亚家族[19]。其中CBF/DREB亚家族成员可以识别干旱和冷诱导响应元件(DRE/CRT，A/GCCGAC)，在非生物胁迫时具有较高的表达[20-21]，而ERF亚家族成员可以识别乙烯应答元件GCC盒(AGCCGCC)，在应对生物胁迫过程中发挥作用[22]。
, 百拇医药
全基因组测序完成的8种模式植物，有合计约850个基因可能属于ERF转录因子家族[23-24]，但是现在克隆了不到50个ERF基因，且相关研究也比较简单，ERF转录因子家族有很大的研究空间，见表1。对于非模式植物，由于缺少合适的对照基因序列和数据支持，其生物学研究远远落后于模式植物。但是，近年转录组学的快速发展所提供的更为快捷的生物信息获取平台，非模式植物的转录组研究可以挖掘跟多层面的物种遗传信息。
新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是传统中药材紫草的道地药材[25]和重要来源，工业价值和药用价值巨大，但是新疆紫草转录因子的研究基本空白[26-27]。本文以新疆紫草转录组为材料构建的本地数据库为基础，结合NCBI数据库，分离新疆紫草ERF转录因子候选基因，并进行系统的注释、分子进化分析和表达分析，以期为ERF转录因子家族的深入研究提供参考，也为非模式植物的生物信息学研究提供理论依据和文献支持。
1 材料
, http://www.100md.com
本研究所用的新疆紫草A. euchroma ERF蛋白序列来源于实验室构建的转录组数据库。新疆紫草转录组测序样品取自细胞生长平顶期，采用Illumina HiSeq2000测序，并使用SOAPdenovo对转录组做从头组装。ERF转录因子家族的信息来自NCBI数据库(http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/)。
2 方法
2.1 新疆紫草ERF基因的分离
在NCBI网站查询和下载新疆紫草或近缘种ERF蛋白序列，以E≤10-6为阈值，BLASTp本地新疆紫草转录组数据库，在检索到的蛋白质序列中，选择含有ERF结构域的序列。由于在NCBI中只有新疆紫草同科属植物紫草Lithospermum erythrorhizon的ERF蛋白质序列，序列号261363612，记为LeERF，以LeERF为Query Sequence，BLASTp本地新疆紫草转录组得到的所有新疆紫草ERF蛋白序列(记为AeERFs)进行InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)进行结构域分析，挑选具有ERF基因家族相似结构域的蛋白作为新疆紫草ERF基因家族成员。
, 百拇医药
2.2 新疆紫草ERF基因结构和表达分析
研究中所有新疆紫草ERF家族基因结构分析使用在线软件GSDS(Gene Structure Display Server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)。新疆紫草ERFs家族基因表达量的计算使用FPKM(Fragments Per kb per Million fragments)法[31]，FPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。
FPKM=106CNL/102
设FPKM(A)为Unigene A的表达量，则C为唯一比对到Unigene A的fragments数，N为唯一比对到所有Unigene的总fragments数，L为Unigene A的碱基数。
2.3 新疆紫草ERF蛋白质结构分析
2.3.1 AeERFs蛋白一级结构理化特性分析 利用在线软件Protparam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、分子式、脂肪族氨基酸数、蛋白质疏水性、不稳定系数等的分析。, 百拇医药(谢腾 王升 黄蕾 王雪 康利平 郭兰萍)
[关键词] ERF; 转录组;新疆紫草;生物信息学
[收稿日期] 2014-06-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81130070，81072989);国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)
[通信作者] 郭兰萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com
, 百拇医药
[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：txwsxtws@163.com
ERF转录因子家族是在植物中发现的一个转录因子大家族[1]，自从1995年克隆得到烟草的ERFs以来，发现ERF家族参与了植物生长、发育中的一系列生物学过程[1-3]，在植物应对旱[4]、盐[5]、冷[6]、热[7]等非生物胁迫和真菌、细菌等生物胁迫[8-9]中起着重要作用。此外，ERF转录因子家族作为赤霉素[10]、茉莉酸[11]、细胞分裂素[12]、水杨酸[13]、乙烯[14]、脱落酸[15]等信号通路交叉互作的连接因子[16-18]，是目前研究的热点之一，有巨大的研究价值。
根据ERF转录因子所结合的顺式作用元件，ERF转录因子家族分为2个大的亚家族：CBF/DREB亚家族和ERF亚家族[19]。其中CBF/DREB亚家族成员可以识别干旱和冷诱导响应元件(DRE/CRT，A/GCCGAC)，在非生物胁迫时具有较高的表达[20-21]，而ERF亚家族成员可以识别乙烯应答元件GCC盒(AGCCGCC)，在应对生物胁迫过程中发挥作用[22]。
, 百拇医药
全基因组测序完成的8种模式植物，有合计约850个基因可能属于ERF转录因子家族[23-24]，但是现在克隆了不到50个ERF基因，且相关研究也比较简单，ERF转录因子家族有很大的研究空间，见表1。对于非模式植物，由于缺少合适的对照基因序列和数据支持，其生物学研究远远落后于模式植物。但是，近年转录组学的快速发展所提供的更为快捷的生物信息获取平台，非模式植物的转录组研究可以挖掘跟多层面的物种遗传信息。
新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是传统中药材紫草的道地药材[25]和重要来源，工业价值和药用价值巨大，但是新疆紫草转录因子的研究基本空白[26-27]。本文以新疆紫草转录组为材料构建的本地数据库为基础，结合NCBI数据库，分离新疆紫草ERF转录因子候选基因，并进行系统的注释、分子进化分析和表达分析，以期为ERF转录因子家族的深入研究提供参考，也为非模式植物的生物信息学研究提供理论依据和文献支持。
1 材料
, http://www.100md.com
本研究所用的新疆紫草A. euchroma ERF蛋白序列来源于实验室构建的转录组数据库。新疆紫草转录组测序样品取自细胞生长平顶期，采用Illumina HiSeq2000测序，并使用SOAPdenovo对转录组做从头组装。ERF转录因子家族的信息来自NCBI数据库(http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/)。
2 方法
2.1 新疆紫草ERF基因的分离
在NCBI网站查询和下载新疆紫草或近缘种ERF蛋白序列，以E≤10-6为阈值，BLASTp本地新疆紫草转录组数据库，在检索到的蛋白质序列中，选择含有ERF结构域的序列。由于在NCBI中只有新疆紫草同科属植物紫草Lithospermum erythrorhizon的ERF蛋白质序列，序列号261363612，记为LeERF，以LeERF为Query Sequence，BLASTp本地新疆紫草转录组得到的所有新疆紫草ERF蛋白序列(记为AeERFs)进行InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)进行结构域分析，挑选具有ERF基因家族相似结构域的蛋白作为新疆紫草ERF基因家族成员。
, 百拇医药
2.2 新疆紫草ERF基因结构和表达分析
研究中所有新疆紫草ERF家族基因结构分析使用在线软件GSDS(Gene Structure Display Server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)。新疆紫草ERFs家族基因表达量的计算使用FPKM(Fragments Per kb per Million fragments)法[31]，FPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。
FPKM=106CNL/102
设FPKM(A)为Unigene A的表达量，则C为唯一比对到Unigene A的fragments数，N为唯一比对到所有Unigene的总fragments数，L为Unigene A的碱基数。
2.3 新疆紫草ERF蛋白质结构分析
2.3.1 AeERFs蛋白一级结构理化特性分析 利用在线软件Protparam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、分子式、脂肪族氨基酸数、蛋白质疏水性、不稳定系数等的分析。, 百拇医药(谢腾 王升 黄蕾 王雪 康利平 郭兰萍)