脾肾阳虚泄泻大鼠模型造模方法研究(1)
[摘要] 脾肾阳虚泄泻是中医常见病症。迄今为止，还没有理想的脾肾阳虚泄泻大鼠模型可供研究。该文通过比较单因素(造模方法Ⅰ，注射氢化可的松+灌胃番泻叶)和复合因素(造模方法Ⅱ，灌胃腺嘌呤+饮食失节+劳倦过度+灌胃番泻叶)2种造模方法，以期建立符合中医证候的脾肾阳虚泄泻大鼠模型。该研究选取大鼠的腹泻指数、尿D-木糖排泄率、NOS/cGMP信号传导系统、脏器指数和病理组织学检查等指标，分别对2个模型组大鼠进行比较评价。结果表明，与正常组相比，造模Ⅰ组、Ⅱ组大鼠的所有考察指标均有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，且造模Ⅱ组在腹泻指数、NOS/cGMP信号通路、肾脏、睾丸和胸腺的脏器指数及病理组织检查等指标表征上与造模Ⅰ组相比有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。综合以上研究，以腺嘌呤致肾阳虚，饮食失节、劳倦过度同灌胃番泻叶致脾阳虚复合因素的造模方法，更符合脾肾阳虚泄泻模型的症候。因此该研究为在此动物模型基础上研究温肾暖脾，涩肠止泻方药的作用提供基础。
[关键词] 脾肾阳虚;泄泻大鼠模型;单因素;复合因素
, 百拇医药
[收稿日期] 2014-04-16
[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(81274085)
[通信作者] *胡昌江，教授，博士生导师，主要从事中药炮制学的教学和科研，Tel：13980980796，E-mail：hhccjj@hotmail.com
[作者简介] 潘新，博士研究生，主要从事中药学研究，Tel：18607196428，E-mail：px520520@126.com
在中医药防病治病研究中，建立相关动物病理模型是关键。关于肾阳虚和脾阳虚的造模方法很多，如注射氢化可的松或灌胃腺嘌呤致肾阳虚;番泻叶泻下、饮食失节、劳倦过度等方法致脾阳虚，但脾肾阳虚泄泻的模型鲜少研究。大量研究结果表明，肾阳虚病理动物模型方法大致有3种，即肾上腺皮质功能受抑制模型(注射糖皮质激素：氢化可的松)、甲状腺功能受抑制模型(灌胃硫脲类药物：甲基硫氧嘧啶)、性腺功能受抑制模型(灌胃腺嘌呤药物)[1-4]。通过查阅文献发现肾阳虚模型以氢化可的松模型最为常见，其次是腺嘌呤致肾阳虚模型，且有研究认为腺嘌呤致肾阳虚模型是属于脾肾阳虚证，而甲状腺功能受抑制模型报道鲜少。而关于建立脾阳虚证的动物模型，常采用苦寒泻下(灌胃大黄或番泻叶)、过劳及饮食失节等方法造模[5-7]。有文献研究认为苦寒泻下法中大黄所致脾阳虚模型病变程度相对较轻，且停用后恢复正常速度快，长期灌服可能会导致便秘。通过对文献的整理和总结及中医药传统理论指导下，本实验拟出2套脾肾阳虚泄泻的造模方法：单因素造模方法(氢化可的松+番泻叶)、复合因素造模方法(腺嘌呤+饮食失节+劳倦过度+番泻叶)，从腹泻指数、尿D-木糖排泄率、NOS/cGMP信号传导系统、脏器指数和病理组织学检查等几个方面对2组模型进行评价，旨在探索出符合中医证候的脾肾阳虚泄泻大鼠模型方法。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，由四川达硕动物实验中心提供。实验动物合格证号0002568，生产许可证号SCXK(川)2013-24。国家中医药管理局中药药理三级科研实验室(No.TCM-03-043)。
1.2 仪器
352型芬兰酶标仪;AC8型芬兰洗板机;TG16W微量高速离心机(国产);GNP-9080 型隔水式恒温培养箱(国产);Thermo可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司 );BP211D AG电子天平(德国Sartorius);徕卡-1015切片机(德国徕卡公司);TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司);BMJ-Ⅲ型包埋机(常州市中威电子仪器有限公司);PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司);Olympus-BX40光学显微镜(日本Olympus公司)。
, http://www.100md.com
1.3 试剂及试药
大鼠环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA试剂盒(上海尚乐生物科技有限公司，批号201310-X02);一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20131120);D-木糖(成都市科龙化工试剂厂，批号20120929);对溴苯胺(天津市光复精细化工研究所，批号20121018);硫脲(成都市科龙化工试剂厂，批号20120919);氢化可的松注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，批号120627);腺嘌呤(成都贝斯特试剂有限公司，批号D110160);番泻叶(购于成都市药材市场)。
对溴苯胺溶液：对溴苯胺2 g溶于100 mL以硫脲饱和过的冰乙酸上清液，当天配用，避光保存。腺嘌呤混悬液：临用前用蒸馏水配置成浓度为200 g·L-1混悬液。番泻叶：加水煮沸约10 min后用2层纱布过滤，滤液减压浓缩成1.0 g·mL-1的药液。
2 方法
, http://www.100md.com
通过预试验发现大鼠体重过轻时在造模过程中死亡率较高，体重在300 g左右开始造模效果较好，故饲养大鼠至300～320 g，随机分组。将60只SD雄性大鼠随机分为正常、造模Ⅰ、造模Ⅱ等3组。除正常组外，其余各组大鼠按以下方法分别造模。
造模Ⅰ方法(氢化可的松+番泻叶)：按10 mL·kg-1剂量臀部皮下注射氢化可的松2周致肾阳虚，从第3周开始灌胃冰番泻叶2周致脾阳虚泻下。造模周期共4周。
造模Ⅱ方法(腺嘌呤+饮食失节+劳倦过度+番泻叶)：腺嘌呤0.2 g·kg-1剂量[8]灌胃4周致肾阳虚;单日、双日交替喂饲甘蓝(10 g/只)和精炼猪油(2 mL /只)致饮食失节，附以每日下午游泳致劳倦过度以伤脾气，从第3周起在之前造模基础上再通过给予灌服冰番泻叶(10 mL·kg-1体重)2周达以伤脾阳，致脾阳虚泻下。造模周期共4周。, http://www.100md.com(潘新 胡昌江 耿媛媛 赵玲 吴文辉 吴晓青 钟振东)
[关键词] 脾肾阳虚;泄泻大鼠模型;单因素;复合因素
, 百拇医药
[收稿日期] 2014-04-16
[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(81274085)
[通信作者] *胡昌江，教授，博士生导师，主要从事中药炮制学的教学和科研，Tel：13980980796，E-mail：hhccjj@hotmail.com
[作者简介] 潘新，博士研究生，主要从事中药学研究，Tel：18607196428，E-mail：px520520@126.com
在中医药防病治病研究中，建立相关动物病理模型是关键。关于肾阳虚和脾阳虚的造模方法很多，如注射氢化可的松或灌胃腺嘌呤致肾阳虚;番泻叶泻下、饮食失节、劳倦过度等方法致脾阳虚，但脾肾阳虚泄泻的模型鲜少研究。大量研究结果表明，肾阳虚病理动物模型方法大致有3种，即肾上腺皮质功能受抑制模型(注射糖皮质激素：氢化可的松)、甲状腺功能受抑制模型(灌胃硫脲类药物：甲基硫氧嘧啶)、性腺功能受抑制模型(灌胃腺嘌呤药物)[1-4]。通过查阅文献发现肾阳虚模型以氢化可的松模型最为常见，其次是腺嘌呤致肾阳虚模型，且有研究认为腺嘌呤致肾阳虚模型是属于脾肾阳虚证，而甲状腺功能受抑制模型报道鲜少。而关于建立脾阳虚证的动物模型，常采用苦寒泻下(灌胃大黄或番泻叶)、过劳及饮食失节等方法造模[5-7]。有文献研究认为苦寒泻下法中大黄所致脾阳虚模型病变程度相对较轻，且停用后恢复正常速度快，长期灌服可能会导致便秘。通过对文献的整理和总结及中医药传统理论指导下，本实验拟出2套脾肾阳虚泄泻的造模方法：单因素造模方法(氢化可的松+番泻叶)、复合因素造模方法(腺嘌呤+饮食失节+劳倦过度+番泻叶)，从腹泻指数、尿D-木糖排泄率、NOS/cGMP信号传导系统、脏器指数和病理组织学检查等几个方面对2组模型进行评价，旨在探索出符合中医证候的脾肾阳虚泄泻大鼠模型方法。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，由四川达硕动物实验中心提供。实验动物合格证号0002568，生产许可证号SCXK(川)2013-24。国家中医药管理局中药药理三级科研实验室(No.TCM-03-043)。
1.2 仪器
352型芬兰酶标仪;AC8型芬兰洗板机;TG16W微量高速离心机(国产);GNP-9080 型隔水式恒温培养箱(国产);Thermo可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司 );BP211D AG电子天平(德国Sartorius);徕卡-1015切片机(德国徕卡公司);TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司);BMJ-Ⅲ型包埋机(常州市中威电子仪器有限公司);PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司);Olympus-BX40光学显微镜(日本Olympus公司)。
, http://www.100md.com
1.3 试剂及试药
大鼠环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA试剂盒(上海尚乐生物科技有限公司，批号201310-X02);一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20131120);D-木糖(成都市科龙化工试剂厂，批号20120929);对溴苯胺(天津市光复精细化工研究所，批号20121018);硫脲(成都市科龙化工试剂厂，批号20120919);氢化可的松注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，批号120627);腺嘌呤(成都贝斯特试剂有限公司，批号D110160);番泻叶(购于成都市药材市场)。
对溴苯胺溶液：对溴苯胺2 g溶于100 mL以硫脲饱和过的冰乙酸上清液，当天配用，避光保存。腺嘌呤混悬液：临用前用蒸馏水配置成浓度为200 g·L-1混悬液。番泻叶：加水煮沸约10 min后用2层纱布过滤，滤液减压浓缩成1.0 g·mL-1的药液。
2 方法
, http://www.100md.com
通过预试验发现大鼠体重过轻时在造模过程中死亡率较高，体重在300 g左右开始造模效果较好，故饲养大鼠至300～320 g，随机分组。将60只SD雄性大鼠随机分为正常、造模Ⅰ、造模Ⅱ等3组。除正常组外，其余各组大鼠按以下方法分别造模。
造模Ⅰ方法(氢化可的松+番泻叶)：按10 mL·kg-1剂量臀部皮下注射氢化可的松2周致肾阳虚，从第3周开始灌胃冰番泻叶2周致脾阳虚泻下。造模周期共4周。
造模Ⅱ方法(腺嘌呤+饮食失节+劳倦过度+番泻叶)：腺嘌呤0.2 g·kg-1剂量[8]灌胃4周致肾阳虚;单日、双日交替喂饲甘蓝(10 g/只)和精炼猪油(2 mL /只)致饮食失节，附以每日下午游泳致劳倦过度以伤脾气，从第3周起在之前造模基础上再通过给予灌服冰番泻叶(10 mL·kg-1体重)2周达以伤脾阳，致脾阳虚泻下。造模周期共4周。, http://www.100md.com(潘新 胡昌江 耿媛媛 赵玲 吴文辉 吴晓青 钟振东)