18份草珊瑚种质的ISSR标记遗传相关性与亲本选配分析(1)
[摘要] 通过ISSR分子标记技术分析18份来源于不同产地并经质量评价的草珊瑚种质的遗传多样性及亲缘关系，并进行亲本选配优化分析，为进一步利用这些种质进行育种奠定一定基础。应用ISSR-PCR分子标记技术研究18个份来自于不同居群的草珊瑚种质的DNA指纹图谱，应用Popgen32软件计算遗传多样性和遗传距离， 并以UPCMA法进行聚类分析。经筛选获得23条多态性引物，ISSR-PCR扩增共获得198条谱带，其中多态性谱带184条，Nei′s基因多样性指数(h) 为0.32，Shannon多样性指数(I) 为0.485 4。供试的草珊瑚种质的遗传相似系数为0.383 8～0.878 8，平均为0.661 2。遗传距离分析揭示了各受试种质相互间的遗传一致性与遗传距离，其中种质S2与种质S18之间的遗传距离最远，为0.957 5，而种质S4与种质S5之间的遗传距离最近，仅为0.129 2。而聚类分析表明种质S1，S2，S3， S7，S10等5个种质在不同程度上有别于其余受试13个种质，并优化了S2与S3，S2与S6，S2与S18等3组较佳亲本选配组合。研究表明受试种质具有较好的遗传多样性，遗传距离分析与聚类分析所揭示的18个种质之间的亲缘关系，并为优化杂交育种的亲本选配提供遗传背景方面可靠的信息。
, 百拇医药
[关键词] 草珊瑚; ISSR; 遗传多样性; 亲缘关系，亲本选配
[收稿日期] 2014-05-29
[基金项目] 福建省教育厅A类项目(JA11138);福建省科技重大项目(2011Y4005)
[通信作者] *梁一池，教授，博士生导师，主要从事中药材品质评价与质量标准研究，E-mail： fafulyc@126.com
[作者简介] 魏艺聪，讲师，研究方向为中药生物技术，E-mail： yicongwei@126.com
草珊瑚Sarcandra glabra是一种广谱中药材， 全株可入药， 具有很高的药用价值。《中国药典》2005 年版列为法定药材使用，还被广泛应用于保健品、食品、饮料及日用化工等方面，市场需求不断扩大，对草珊瑚原料需求也不断增加。近几年来， 草珊瑚野生资源急剧减少，收集优良种质，通过人工育种及人工栽培是保障草珊瑚资源可持续利用的必然要求[1-3]。药材的产量与品质性状属于数量性状，易受环境条件的影响，只根据性状表现进行种质选择效果不好，而有些性状虽受少数主基因控制，但也受遗传背景、微效基因等因素的影响。运用DNA指纹图谱的方法进行其遗传多态性研究可以从遗传背景分析种质材料之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定种质之间的遗传距离，在杂交育种时指导亲本的选配，为杂种优势群的划分，减少杂交组合数，提高育种效率提供基因背景方面的依据[4-6]。利用分子标记，是进行药材品质性状选择的有效途径。
, 百拇医药
ISSR(inter-simple sequence repeat)即简单序列重复区间扩增多态性分子标记是近年来发展起来的十分有效的分子标记技术， 具有稳定、多态性高， 简便及易操作等优点，被视为理想的遗传标记方法[7-10]。
本研究利用ISSR分子标记技术对18个不同产地、不同品质性状的草珊瑚种质资源进行遗传多样性与亲缘关系研究，为进一步合理利用这些资源进行杂交育种或者分子辅助育种提供可靠的遗传背景信息。
1 材料
PCR 仪(Eppendorf，型号5332) ，电泳系统( 北京市六一仪器厂，型号DYY-12) ，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R) ，凝胶成像分析仪(BIO-RAD ChemiDoc XRS)，微量移液器(Eppendorf) 。
2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖(Promega公司) ，溴化乙锭(Fluka公司) ，Trans Start Top Taq DNA Polymerase(北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。
, 百拇医药
本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教授鉴定并收集的采自不同产地的18批样品，为金粟兰科植物草珊瑚，集中种植于福建中医药大学时珍园，本课题组已通过HPLC特征指纹图谱分析方法对这18个草珊瑚样品的7个活性成分进行了分析[11]，并按优、良、中与差把18个样品进行了分级，并进行了随机的编号(表1)。
表1 18份实验材料概况
Table 1 Basic information of 18 materials
No.原产地 (经度/纬度)品质等级
S1118°12′/26°58′低
S2118°17′/26°64′中
S3118°29′ /25°32′中
, 百拇医药
S4118°17′/25°05′中
S5114°71′/23°74′低
S6117°45′/26°25′高
S7119°32′/26°17′低
S8114°94′/25°80′低
S9116°50′/25°31′中
S10117°45′/ 26°17′低
S11117°35′/26°33′低
S12116°77′/25°70′中
S13117°55′/30°00′中
, 百拇医药
S14117°30′/24°35′低
S15117°41′/25°29′低
S16118°97′/25°85′低
S17118°13′/27°33′低
S18119°06′/26°08′中
2 方法
2.1 草珊瑚基因组DNA 的提取和纯化 采取受试18个草珊瑚种质各3个植株的嫩叶，采用经本研究室改良的CTAB 法分别提取这18个草珊瑚种质幼嫩叶片的基因组DNA， 以1%琼脂糖凝胶电泳检测。并纯化所提取的样品DNA。, 百拇医药(魏艺聪 陈莹 罗林泉 杨群雄 陈艺娟 梁一池)
, 百拇医药
[关键词] 草珊瑚; ISSR; 遗传多样性; 亲缘关系，亲本选配
[收稿日期] 2014-05-29
[基金项目] 福建省教育厅A类项目(JA11138);福建省科技重大项目(2011Y4005)
[通信作者] *梁一池，教授，博士生导师，主要从事中药材品质评价与质量标准研究，E-mail： fafulyc@126.com
[作者简介] 魏艺聪，讲师，研究方向为中药生物技术，E-mail： yicongwei@126.com
草珊瑚Sarcandra glabra是一种广谱中药材， 全株可入药， 具有很高的药用价值。《中国药典》2005 年版列为法定药材使用，还被广泛应用于保健品、食品、饮料及日用化工等方面，市场需求不断扩大，对草珊瑚原料需求也不断增加。近几年来， 草珊瑚野生资源急剧减少，收集优良种质，通过人工育种及人工栽培是保障草珊瑚资源可持续利用的必然要求[1-3]。药材的产量与品质性状属于数量性状，易受环境条件的影响，只根据性状表现进行种质选择效果不好，而有些性状虽受少数主基因控制，但也受遗传背景、微效基因等因素的影响。运用DNA指纹图谱的方法进行其遗传多态性研究可以从遗传背景分析种质材料之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定种质之间的遗传距离，在杂交育种时指导亲本的选配，为杂种优势群的划分，减少杂交组合数，提高育种效率提供基因背景方面的依据[4-6]。利用分子标记，是进行药材品质性状选择的有效途径。
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ISSR(inter-simple sequence repeat)即简单序列重复区间扩增多态性分子标记是近年来发展起来的十分有效的分子标记技术， 具有稳定、多态性高， 简便及易操作等优点，被视为理想的遗传标记方法[7-10]。
本研究利用ISSR分子标记技术对18个不同产地、不同品质性状的草珊瑚种质资源进行遗传多样性与亲缘关系研究，为进一步合理利用这些资源进行杂交育种或者分子辅助育种提供可靠的遗传背景信息。
1 材料
PCR 仪(Eppendorf，型号5332) ，电泳系统( 北京市六一仪器厂，型号DYY-12) ，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R) ，凝胶成像分析仪(BIO-RAD ChemiDoc XRS)，微量移液器(Eppendorf) 。
2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖(Promega公司) ，溴化乙锭(Fluka公司) ，Trans Start Top Taq DNA Polymerase(北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。
, 百拇医药
本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教授鉴定并收集的采自不同产地的18批样品，为金粟兰科植物草珊瑚，集中种植于福建中医药大学时珍园，本课题组已通过HPLC特征指纹图谱分析方法对这18个草珊瑚样品的7个活性成分进行了分析[11]，并按优、良、中与差把18个样品进行了分级，并进行了随机的编号(表1)。
表1 18份实验材料概况
Table 1 Basic information of 18 materials
No.原产地 (经度/纬度)品质等级
S1118°12′/26°58′低
S2118°17′/26°64′中
S3118°29′ /25°32′中
, 百拇医药
S4118°17′/25°05′中
S5114°71′/23°74′低
S6117°45′/26°25′高
S7119°32′/26°17′低
S8114°94′/25°80′低
S9116°50′/25°31′中
S10117°45′/ 26°17′低
S11117°35′/26°33′低
S12116°77′/25°70′中
S13117°55′/30°00′中
, 百拇医药
S14117°30′/24°35′低
S15117°41′/25°29′低
S16118°97′/25°85′低
S17118°13′/27°33′低
S18119°06′/26°08′中
2 方法
2.1 草珊瑚基因组DNA 的提取和纯化 采取受试18个草珊瑚种质各3个植株的嫩叶，采用经本研究室改良的CTAB 法分别提取这18个草珊瑚种质幼嫩叶片的基因组DNA， 以1%琼脂糖凝胶电泳检测。并纯化所提取的样品DNA。, 百拇医药(魏艺聪 陈莹 罗林泉 杨群雄 陈艺娟 梁一池)