葛根芩连方中多成分肠渗透性的原药材归属研究(1)
[摘要] 中药生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS)构建的复杂层面为中药复方研究，在坚持多成分同时测定的前提下，开展渗透性研究时，其首要任务是明确透过肠壁而被吸收的成分来源，即具体归属于中药复方中的哪味药材。该研究利用化学成分指纹图谱技术(chemical fingerprint)，采用离体翻转肠囊实验技术对经典名方葛根芩连方中的肠渗透多成分进行直观来源归属，为下一步的肠渗透性定性及定量研究奠定基础。
[关键词] 中药生物药剂学分类系统;葛根芩连方;渗透性;离体翻转肠囊;多成分;化学成分指纹图谱
[收稿日期] 2014-07-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81473362);北京中医药大学创新团队发展计划项目(2011-CXTD-13)
, 百拇医药
[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：(010)64286245，E-mail：dongling@bucm.edu.cn;*刘洋，副教授，硕士生导师， 主要从事药物代谢研究，Tel：(010)84738629，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn
[作者简介] 朱美玲，硕士研究生，E-mail：1049613109@qq.com
中药生物药剂学分类系统的分类依据中，渗透性是重要指标之一，但因中药成分的复杂性，尤其是中药复方，需按照肠渗透成分归属、肠渗透成分定性和肠渗透成分定量分析的过程，逐步阐述。为坚持中药多成分整体性研究的原则，利用化学成分指纹图谱技术，运用单味药材和复方交叉对比的方法，开展肠渗透多成分的原药材归属研究是可行的。肠渗透性实验方法很多，通过前期的实验方法研究，因离体外翻肠囊法的多成分指纹图谱直观性最优，而被选中。该方法最初是由Wilson和Wiseman于1954年创建[1]，具有直接、快速反映吸收行为，可控、简便调整实验条件的优势，虽定量准确性稍差，但却是研究锁定吸收成分的有效手段。葛根芩连方是源于《伤寒论》的经典名方，由葛根、甘草、黄芩和黄连组成。目前对于其药效成分和质量控制具有广泛而深入的研究报道[2-3]，但对于其整体的多成分肠渗透性却未见文献报道。因此本研究对葛根芩连方进行实验，探索其组方各味药材的主要成分在葛根芩连方的多成分环境下，是否可以被吸收，从而为下一步的多成分肠渗透性定性和定量分析提供基础支撑。
, 百拇医药
1 材料
1.1 仪器
Waters液相色谱系统(600四元泵，美国Waters公司);2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;电子分析天平(BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司);超声波清洗器(KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司)。
1.2 药物
葛根、黄芩、黄连及甘草购买于北京同仁堂药店;葛根素对照品(批号110752-200912，中国食品药品检定研究院);葛根素原料(批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司);黄芩苷原料(批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司);盐酸小檗碱原料(批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司);甘草酸单铵原料(批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司)。
, 百拇医药
1.3 试剂
乙腈购买于美国Fisher公司(色谱级);乙酸、三乙胺、磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂(分析级);娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)。
1.4 动物
Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK(京)2012-0001。
2 方法
2.1 葛根芩连方多成分色谱指纹图谱分析方法的建立
采用高效液相色谱法测定，参照相关文献[4]，色谱条件为：Thermo Scientific，Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流速1.0 mL·min-1;检测波长270 nm;柱温室温;进样量10 μL;缓冲溶液(1%三乙胺，1%乙酸，用磷酸调pH到3.0，A)-甲醇(B)进行梯度洗脱(0～12 min，76%A;12～13 min，76%～72%A;13～19 min，72%A;19～20 min，72%～66.2%A;20～37.5 min，66.2%A;37.5～38.5 min，66.2%～59%A;38.5～60 min，59%～25%A)。
, 百拇医药
2.2 葛根芩连方及其组方药材的离体翻转肠囊法多成分吸收定性研究
2.2.1 人工肠液的制备 称取葡萄糖0.7 g，氯化镁0.01 g，磷酸二氢钠0.16 g，氯化钠3.9 g，氯化钾0.175 g，氯化钙0.185 g，碳酸氢钠0.685 g，用蒸馏水定容于500 mL量瓶中，备用。
2.2.2 肠吸收药液的制备 称取复方中的各味药材研成粉末(全部过20目筛)，取适量用50%甲醇超声提取1 h，时时振摇，将提取液浓缩至无甲醇味，加人工肠液制成一定浓度药液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。
2.2.3 大鼠离体翻转肠囊模型实验方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠，水合氯醛麻醉，小心将肠管同肠系膜剥离，分别取小肠10 cm，放入37 ℃的人工肠液中，冲洗至无内容物流出。小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，将肠管一端结扎于自制塑料套管，小心将肠管翻转，向肠囊内注入1 mL空白人工肠液，结扎另一端，放入37 ℃恒温的药液中，通入氧气。孵育1 h后将肠囊取出，擦净表面液体，倾出液体。过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。, 百拇医药(朱美玲 杨文宁 董玲 董红环 侯成波 刘洋)
[关键词] 中药生物药剂学分类系统;葛根芩连方;渗透性;离体翻转肠囊;多成分;化学成分指纹图谱
[收稿日期] 2014-07-18
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81473362);北京中医药大学创新团队发展计划项目(2011-CXTD-13)
, 百拇医药
[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：(010)64286245，E-mail：dongling@bucm.edu.cn;*刘洋，副教授，硕士生导师， 主要从事药物代谢研究，Tel：(010)84738629，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn
[作者简介] 朱美玲，硕士研究生，E-mail：1049613109@qq.com
中药生物药剂学分类系统的分类依据中，渗透性是重要指标之一，但因中药成分的复杂性，尤其是中药复方，需按照肠渗透成分归属、肠渗透成分定性和肠渗透成分定量分析的过程，逐步阐述。为坚持中药多成分整体性研究的原则，利用化学成分指纹图谱技术，运用单味药材和复方交叉对比的方法，开展肠渗透多成分的原药材归属研究是可行的。肠渗透性实验方法很多，通过前期的实验方法研究，因离体外翻肠囊法的多成分指纹图谱直观性最优，而被选中。该方法最初是由Wilson和Wiseman于1954年创建[1]，具有直接、快速反映吸收行为，可控、简便调整实验条件的优势，虽定量准确性稍差，但却是研究锁定吸收成分的有效手段。葛根芩连方是源于《伤寒论》的经典名方，由葛根、甘草、黄芩和黄连组成。目前对于其药效成分和质量控制具有广泛而深入的研究报道[2-3]，但对于其整体的多成分肠渗透性却未见文献报道。因此本研究对葛根芩连方进行实验，探索其组方各味药材的主要成分在葛根芩连方的多成分环境下，是否可以被吸收，从而为下一步的多成分肠渗透性定性和定量分析提供基础支撑。
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1 材料
1.1 仪器
Waters液相色谱系统(600四元泵，美国Waters公司);2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;电子分析天平(BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司);超声波清洗器(KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司)。
1.2 药物
葛根、黄芩、黄连及甘草购买于北京同仁堂药店;葛根素对照品(批号110752-200912，中国食品药品检定研究院);葛根素原料(批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司);黄芩苷原料(批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司);盐酸小檗碱原料(批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司);甘草酸单铵原料(批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司)。
, 百拇医药
1.3 试剂
乙腈购买于美国Fisher公司(色谱级);乙酸、三乙胺、磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂(分析级);娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)。
1.4 动物
Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK(京)2012-0001。
2 方法
2.1 葛根芩连方多成分色谱指纹图谱分析方法的建立
采用高效液相色谱法测定，参照相关文献[4]，色谱条件为：Thermo Scientific，Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流速1.0 mL·min-1;检测波长270 nm;柱温室温;进样量10 μL;缓冲溶液(1%三乙胺，1%乙酸，用磷酸调pH到3.0，A)-甲醇(B)进行梯度洗脱(0～12 min，76%A;12～13 min，76%～72%A;13～19 min，72%A;19～20 min，72%～66.2%A;20～37.5 min，66.2%A;37.5～38.5 min，66.2%～59%A;38.5～60 min，59%～25%A)。
, 百拇医药
2.2 葛根芩连方及其组方药材的离体翻转肠囊法多成分吸收定性研究
2.2.1 人工肠液的制备 称取葡萄糖0.7 g，氯化镁0.01 g，磷酸二氢钠0.16 g，氯化钠3.9 g，氯化钾0.175 g，氯化钙0.185 g，碳酸氢钠0.685 g，用蒸馏水定容于500 mL量瓶中，备用。
2.2.2 肠吸收药液的制备 称取复方中的各味药材研成粉末(全部过20目筛)，取适量用50%甲醇超声提取1 h，时时振摇，将提取液浓缩至无甲醇味，加人工肠液制成一定浓度药液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。
2.2.3 大鼠离体翻转肠囊模型实验方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠，水合氯醛麻醉，小心将肠管同肠系膜剥离，分别取小肠10 cm，放入37 ℃的人工肠液中，冲洗至无内容物流出。小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，将肠管一端结扎于自制塑料套管，小心将肠管翻转，向肠囊内注入1 mL空白人工肠液，结扎另一端，放入37 ℃恒温的药液中，通入氧气。孵育1 h后将肠囊取出，擦净表面液体，倾出液体。过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。, 百拇医药(朱美玲 杨文宁 董玲 董红环 侯成波 刘洋)