丹红有效成分配伍对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用(1)
[摘要]为研究丹红有效成分配伍对缺氧致原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞(rBMECs)损伤的保护作用。原代培养乳鼠脑微血管内皮细胞并对细胞进行缺氧4 h损伤模型的同时，丹红有效成分(原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色素A、丹参素)配伍作用于rBMECs，MTT确定细胞非毒性剂量，采用比色法测定LDH，SOD活性和MDA水平，RT-PCR法检测ICAM-1，MMP-9，P53 mRNA表达，流式细胞术检测rBMECs细胞周期及早期凋亡的变化。丹红有效成分配伍1，2，3，7，8，9组方显著抑制缺氧细胞上清液中LDH的增加；1，2，4，6，7组方显著增强缺氧细胞内SOD活性；1，2，3，8，9组方显著降低MDA水平；1，2，6，7，9组方显著抑制缺氧诱导的rBMECs早期凋亡，缺氧后细胞P53 mRNA表达明显上调的后果是能引起G1期阻滞和促进细胞凋亡，证实P53基因的调节功能体现在G1期校正点的监测；1，2，5，6，7，8，9组方显著下调P53 mRNA表达；1，4，7，8，9组方显著下调ICAM-1 mRNA表达；1，3，6，9组方显著下调MMP-9 mRNA表达。丹红有效成分配伍对缺氧所致原代培养的rBMECs损伤具有明显的保护作用，其机制与增强细胞抗氧化能力，抑制炎症反应和细胞凋亡有关。为研究方剂配伍规律提供思路，指导临床用药。
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[关键词]有效成分配伍；乳鼠脑微血管内皮细胞；细胞凋亡；抗氧化；抗炎症
心脑血管疾病是一种严重威胁人类特别是中老年人健康的常见病。心脑血管疾病具有“发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高、并发症多”，“四高一多”的特点。丹红配伍、丹红注射液已成为治疗急性缺血性脑血管病(如脑梗死)的有效方药[1-3]。丹参与红花配伍已是临床上活血化瘀类方剂常用的经典配伍，有“药对”之称，常用于治疗心脑血管疾病或其他疾患血瘀证。丹红配伍广泛地用于血瘀证的治疗。但中医学针对任何病证(包括缺血性中风血瘀证)治疗，应有最佳的中药配伍。因此，寻求治疗缺血性中风血瘀证的最佳丹红活性物质配伍是本实验的主要研究目标。采用原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞建立rBMECs缺氧损伤模型，基于药物相互作用原理，探讨丹红有效成分配伍机制，逐步建立中药配伍研究的新方法。
1材料
1.1药品与试剂羟基红花黄色素A(天津马克生物技术有限公司，批号120829)；丹参素钠(上海同田生物有限公司，批号12110821)；丹酚酸B(上海同田生物有限公司，批号12091221)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，批号110810-201007)；M199培养基、胎牛血清(Gibco公司)；D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、胰蛋白酶、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭(PI)、Folin-酚试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I，PI/RNase Staining Buffer 试剂盒(BD公司)；引物Rat β-actin，MMP-9，ICAM-1，P53(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit(Roche公司)；All-in-OneTM Q-PCR Primer Array(GeneCopoeia公司)；其余试剂均为市售分析纯。
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1.2动物SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK(沪)2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.3仪器SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化设备有限公司)；3111型CO2培养箱(Thermo Scientific公司)；DMI4000B荧光倒置显微镜(德国徕卡公司)；LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京京立离心机有限公司)；MD SpectraMax Plus384全波长酶标仪(美国Molecular Devices)；BD FACSCulibur流式细胞仪(美国BD公司)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD)；eppendorf移液枪，自制缺氧罐。
2方法
2.1rBMECs的原代培养[4]取3～5日龄SD乳鼠，断头收集脑皮质，用预冷D-Hank′s液漂洗3次后，充分剪碎至1 mm3。以含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。弃上清，加入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液，吹打均匀，37 ℃消化25 min，每5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种至培养瓶中，37 ℃，5%CO2 培养箱培养，约7～8 d细胞生长成致密单层，出现“铺路石”征象后可进行传代培养，以第3代细胞用于实验。
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2.2大鼠脑血管内皮细胞缺氧损伤模型的建立取第3代rBMECs传代于相应的培养器皿中，培养24 h后长成致密单层，把培养液换成M199培养液，放置于缺氧罐(温度37 ℃，持续通入95%N2+5%CO2 的混合气体充满缺氧罐，15 min后封口膜密封缺氧罐接口置于37 ℃恒温箱中4 h。造成细胞缺氧损伤模型。
2.3分组根据MTT法细胞毒性实验结果原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色A、丹参素的浓度分别在0～200，0～100，0～150，0～300 mg·L-1为非细胞毒性剂量，即各药物与细胞共同培养4 h后，细胞存活率大于90%，选取适宜浓度进行下一步研究。在各有效成分的非细胞毒性剂量范围内选取高、中、低浓度，见表1，按照正交试验设计L9(34)原则和M199培养基配成9组含药无血清培养液。以下实验均分11组：正常对照组、模型组、9组给药组。, 百拇医药(周惠芬 何昱 张宇燕 杨洁红 赵涛 付巍 周鹏 万海同)
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[关键词]有效成分配伍；乳鼠脑微血管内皮细胞；细胞凋亡；抗氧化；抗炎症
心脑血管疾病是一种严重威胁人类特别是中老年人健康的常见病。心脑血管疾病具有“发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高、并发症多”，“四高一多”的特点。丹红配伍、丹红注射液已成为治疗急性缺血性脑血管病(如脑梗死)的有效方药[1-3]。丹参与红花配伍已是临床上活血化瘀类方剂常用的经典配伍，有“药对”之称，常用于治疗心脑血管疾病或其他疾患血瘀证。丹红配伍广泛地用于血瘀证的治疗。但中医学针对任何病证(包括缺血性中风血瘀证)治疗，应有最佳的中药配伍。因此，寻求治疗缺血性中风血瘀证的最佳丹红活性物质配伍是本实验的主要研究目标。采用原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞建立rBMECs缺氧损伤模型，基于药物相互作用原理，探讨丹红有效成分配伍机制，逐步建立中药配伍研究的新方法。
1材料
1.1药品与试剂羟基红花黄色素A(天津马克生物技术有限公司，批号120829)；丹参素钠(上海同田生物有限公司，批号12110821)；丹酚酸B(上海同田生物有限公司，批号12091221)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，批号110810-201007)；M199培养基、胎牛血清(Gibco公司)；D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、胰蛋白酶、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭(PI)、Folin-酚试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I，PI/RNase Staining Buffer 试剂盒(BD公司)；引物Rat β-actin，MMP-9，ICAM-1，P53(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit(Roche公司)；All-in-OneTM Q-PCR Primer Array(GeneCopoeia公司)；其余试剂均为市售分析纯。
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1.2动物SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK(沪)2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.3仪器SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化设备有限公司)；3111型CO2培养箱(Thermo Scientific公司)；DMI4000B荧光倒置显微镜(德国徕卡公司)；LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京京立离心机有限公司)；MD SpectraMax Plus384全波长酶标仪(美国Molecular Devices)；BD FACSCulibur流式细胞仪(美国BD公司)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD)；eppendorf移液枪，自制缺氧罐。
2方法
2.1rBMECs的原代培养[4]取3～5日龄SD乳鼠，断头收集脑皮质，用预冷D-Hank′s液漂洗3次后，充分剪碎至1 mm3。以含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。弃上清，加入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液，吹打均匀，37 ℃消化25 min，每5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种至培养瓶中，37 ℃，5%CO2 培养箱培养，约7～8 d细胞生长成致密单层，出现“铺路石”征象后可进行传代培养，以第3代细胞用于实验。
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2.2大鼠脑血管内皮细胞缺氧损伤模型的建立取第3代rBMECs传代于相应的培养器皿中，培养24 h后长成致密单层，把培养液换成M199培养液，放置于缺氧罐(温度37 ℃，持续通入95%N2+5%CO2 的混合气体充满缺氧罐，15 min后封口膜密封缺氧罐接口置于37 ℃恒温箱中4 h。造成细胞缺氧损伤模型。
2.3分组根据MTT法细胞毒性实验结果原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色A、丹参素的浓度分别在0～200，0～100，0～150，0～300 mg·L-1为非细胞毒性剂量，即各药物与细胞共同培养4 h后，细胞存活率大于90%，选取适宜浓度进行下一步研究。在各有效成分的非细胞毒性剂量范围内选取高、中、低浓度，见表1，按照正交试验设计L9(34)原则和M199培养基配成9组含药无血清培养液。以下实验均分11组：正常对照组、模型组、9组给药组。, 百拇医药(周惠芬 何昱 张宇燕 杨洁红 赵涛 付巍 周鹏 万海同)