分离培养方法结合PCR—SSCP技术分析六神曲中的真菌类群(1)
[摘要] 目的：采用传统分离培养方法结合PCR-SSCP技术对六神曲中的真菌类群进行分析，为全面了解六神曲中的功能菌群奠定基础。方法：采用直接分离法获得六神曲中的可培养真菌，根据形态学及DNA序列特征对得到的真菌进行鉴定；同时提取六神曲中真菌的总DNA，采用基于β-tubulin基因片段的聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析其中所包含的真菌种类。结果：采用传统分离培养的方法，从生神曲中只得到黄曲霉Aspergillus flavus和米根霉Rhizopus oryzae；从焦神曲中得到黄曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger。PCR-SSCP分析结果显示生神曲中含有3属5种真菌，其中A. ambiguus以及A. ivoriensis占优势，相对多度分别为57%，35%，与培养方法共有的种类为A. flavus，相对多度仅为4%；但未从焦神曲中获得阳性克隆。结论：在六神曲中的真菌多样性分析中，通过PCR-SSCP分析技术能从DNA水平上发现传统分离培养方法无法获得的真菌种类，结合2种方法可以更全面地解析参与六神曲发酵的功能真菌。
, 百拇医药
[关键词] 六神曲；可培养真菌；β-tubulin基因；PCR-SSCP技术；真菌类群
六神曲又名六曲、神曲，是一味应用历史悠久的曲类中药，由面粉或麸皮、赤小豆、苦杏仁、鲜青蒿、鲜苍耳、鲜辣蓼等按一定比例混匀后发酵而成。最早收载于《药性论》中，味甘、辛，性温，归脾、胃经。具有健脾和胃，消食调中的功效。用于治疗饮食停滞，胸痞腹胀，呕吐泻痢，产后瘀血腹痛，小儿腹大坚积等[1]。另外临床研究还表明神曲具有良好的肠道菌群调整作用和肠保护作用[2]。神曲除了直接应用于临床，还是中成药特别是含发酵类药材中成药的主要原材料，在2010年版《中国药典》收录的含发酵类药材中成药中超过80%(85种)含神曲成分[3]。
神曲的传统制备工艺是在自然条件下进行开放式的发酵，以曲块表面生黄白色菌丝作为发酵的终点[4-5]。干燥后直接入药的为生神曲，经过适度翻炒至表面焦黄后入药的为焦神曲，焦神曲中微生物，淀粉酶，蛋白酶等失活，主要利用焦香之味醒脾健胃[6]。研究发酵过程中的优势菌种是阐明神曲发酵机制的基础，前人通过分离培养的方法对神曲中的真菌类群进行了较多研究，但结果不尽相同：芦艳卿等报道神曲中含有真菌3属4个组，包括青霉属的分枝青霉组、曲霉属的烟曲霉组和巢曲霉组、毛霉属的总状毛霉组[7]；高慧等对单一菌种发酵神曲的质量进行比较研究，发现曲霉属真菌及毛霉属真菌单菌发酵的神曲与传统发酵的神曲相比，化学成分，蛋白酶及淀粉酶活力相同，推断霉菌是其发酵的主要菌种[8]；而邬吉野等从生神曲中分离出黄曲霉，伞枝犁头霉，杂色曲霉，肉色曲霉等，且其中的黄曲霉单独发酵，能显著提高神曲淀粉酶和蛋白酶的活力[9]。
, http://www.100md.com
在进行微生物多样性研究中，传统分离方法虽然可以分离出单一菌种，但是却无法获得生长较慢或无法培养的种类，只能发现样品中极少部分(0.1%～1%)可培养的类群，无法反映真实的真菌群落结构[10]。PCR-SSCP技术是在PCR技术基础上发展起来的，利用单链DNA构象多态性来分析环境微生物多样性的有效方法，它的出现克服了传统方法的限制，可以从基因水平上估计物种的丰度、均度及变异情况等，并且具有灵敏、快速、操作简便、重复性好等诸多优势，已经被广泛用于多种基质的微生物群落结构研究[11-12]。Zhang等采用PCR-SSCP技术对中药材冬虫夏草的真菌类群进行了分析，发现97%的可分类操作单元(operational taxonomic units， OTU)仅能通过非培养的PCR-SSCP方法获得，通过该方法大大加深了对冬虫夏草复杂真菌类群的认识[13]。本研究拟采用传统分离培养的方法结合非培养的PCR-SSCP技术对神曲中的真菌类群进行分析，为客观评价六神曲中不同真菌的功能提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 六神曲样品的采集
六神曲生品(生神曲)及炮制品(焦神曲)于2012年5月至6月购自北京同仁堂药店，每家药店购买1份样品，2种药材共在3家药店购买6份样品，每份样品500 g，均经过作者鉴定。采集的样品用无菌纸袋包装，并在1周内完成真菌的分离及总DNA的提取。
1.2 真菌的分离及鉴定
将神曲样品放置在无菌培养皿中保湿培养，3 d后在体式显微镜下观察，用无菌挑针对其上长出的真菌孢子进行单孢分离，挑出的真菌于麦芽汁培养基(MEA)上25 ℃培养，7 d后对长出的菌落进行形态学的初步鉴定。针对其中的曲霉属真菌采用查氏酵母浸出液培养基(CYA)、麦芽汁培养基(MEA)进行继代培养。25 ℃培养7 d后观察菌落的培养性状及显微特征，参考Pitt及Raper的方法进行鉴定[14-15]。其他真菌的鉴定在马铃薯琼脂培养基(PDA)上观察菌落的培养性状及显微特征，参考Carmichael的进行鉴定[16]。同时根据Chen的方法[17]提取菌株的基因组DNA，针对青霉属及曲霉属真菌扩增β-tubulin基因片段，其他属真菌扩增ITS4片段，对PCR产物进行测序并通过BLAST软件与GenBank核酸数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相关序列进行同源性比较，结合形态学鉴定的结果对分离菌株进行系统鉴定。
1.3 基于β-tubulin基因的PCR-SSCP方法的建立
通过标准菌株对引物、PCR反应体系及程序、SSCP实验参数等进行优化，并通过本课题组前期研究积累的12属21种真菌的纯培养物对优化好的SSCP方法进行了验证。, 百拇医药(陈娟 焦晓林 杨春勇 宋美芳 高微微)
, 百拇医药
[关键词] 六神曲；可培养真菌；β-tubulin基因；PCR-SSCP技术；真菌类群
六神曲又名六曲、神曲，是一味应用历史悠久的曲类中药，由面粉或麸皮、赤小豆、苦杏仁、鲜青蒿、鲜苍耳、鲜辣蓼等按一定比例混匀后发酵而成。最早收载于《药性论》中，味甘、辛，性温，归脾、胃经。具有健脾和胃，消食调中的功效。用于治疗饮食停滞，胸痞腹胀，呕吐泻痢，产后瘀血腹痛，小儿腹大坚积等[1]。另外临床研究还表明神曲具有良好的肠道菌群调整作用和肠保护作用[2]。神曲除了直接应用于临床，还是中成药特别是含发酵类药材中成药的主要原材料，在2010年版《中国药典》收录的含发酵类药材中成药中超过80%(85种)含神曲成分[3]。
神曲的传统制备工艺是在自然条件下进行开放式的发酵，以曲块表面生黄白色菌丝作为发酵的终点[4-5]。干燥后直接入药的为生神曲，经过适度翻炒至表面焦黄后入药的为焦神曲，焦神曲中微生物，淀粉酶，蛋白酶等失活，主要利用焦香之味醒脾健胃[6]。研究发酵过程中的优势菌种是阐明神曲发酵机制的基础，前人通过分离培养的方法对神曲中的真菌类群进行了较多研究，但结果不尽相同：芦艳卿等报道神曲中含有真菌3属4个组，包括青霉属的分枝青霉组、曲霉属的烟曲霉组和巢曲霉组、毛霉属的总状毛霉组[7]；高慧等对单一菌种发酵神曲的质量进行比较研究，发现曲霉属真菌及毛霉属真菌单菌发酵的神曲与传统发酵的神曲相比，化学成分，蛋白酶及淀粉酶活力相同，推断霉菌是其发酵的主要菌种[8]；而邬吉野等从生神曲中分离出黄曲霉，伞枝犁头霉，杂色曲霉，肉色曲霉等，且其中的黄曲霉单独发酵，能显著提高神曲淀粉酶和蛋白酶的活力[9]。
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在进行微生物多样性研究中，传统分离方法虽然可以分离出单一菌种，但是却无法获得生长较慢或无法培养的种类，只能发现样品中极少部分(0.1%～1%)可培养的类群，无法反映真实的真菌群落结构[10]。PCR-SSCP技术是在PCR技术基础上发展起来的，利用单链DNA构象多态性来分析环境微生物多样性的有效方法，它的出现克服了传统方法的限制，可以从基因水平上估计物种的丰度、均度及变异情况等，并且具有灵敏、快速、操作简便、重复性好等诸多优势，已经被广泛用于多种基质的微生物群落结构研究[11-12]。Zhang等采用PCR-SSCP技术对中药材冬虫夏草的真菌类群进行了分析，发现97%的可分类操作单元(operational taxonomic units， OTU)仅能通过非培养的PCR-SSCP方法获得，通过该方法大大加深了对冬虫夏草复杂真菌类群的认识[13]。本研究拟采用传统分离培养的方法结合非培养的PCR-SSCP技术对神曲中的真菌类群进行分析，为客观评价六神曲中不同真菌的功能提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 六神曲样品的采集
六神曲生品(生神曲)及炮制品(焦神曲)于2012年5月至6月购自北京同仁堂药店，每家药店购买1份样品，2种药材共在3家药店购买6份样品，每份样品500 g，均经过作者鉴定。采集的样品用无菌纸袋包装，并在1周内完成真菌的分离及总DNA的提取。
1.2 真菌的分离及鉴定
将神曲样品放置在无菌培养皿中保湿培养，3 d后在体式显微镜下观察，用无菌挑针对其上长出的真菌孢子进行单孢分离，挑出的真菌于麦芽汁培养基(MEA)上25 ℃培养，7 d后对长出的菌落进行形态学的初步鉴定。针对其中的曲霉属真菌采用查氏酵母浸出液培养基(CYA)、麦芽汁培养基(MEA)进行继代培养。25 ℃培养7 d后观察菌落的培养性状及显微特征，参考Pitt及Raper的方法进行鉴定[14-15]。其他真菌的鉴定在马铃薯琼脂培养基(PDA)上观察菌落的培养性状及显微特征，参考Carmichael的进行鉴定[16]。同时根据Chen的方法[17]提取菌株的基因组DNA，针对青霉属及曲霉属真菌扩增β-tubulin基因片段，其他属真菌扩增ITS4片段，对PCR产物进行测序并通过BLAST软件与GenBank核酸数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相关序列进行同源性比较，结合形态学鉴定的结果对分离菌株进行系统鉴定。
1.3 基于β-tubulin基因的PCR-SSCP方法的建立
通过标准菌株对引物、PCR反应体系及程序、SSCP实验参数等进行优化，并通过本课题组前期研究积累的12属21种真菌的纯培养物对优化好的SSCP方法进行了验证。, 百拇医药(陈娟 焦晓林 杨春勇 宋美芳 高微微)