黄葵胶囊抑制糖尿病肾病肾组织氧化应激和p38MAPK信号通路活性改善肾纤维化的作用和机制(1)
[摘要] 目的：探讨黄葵胶囊(Huangkui capsule，HKC)改善糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)模型鼠肾纤维化的作用和机制。方法：将大鼠随机分为5组，假手术组5只，模型组、HKC低剂量(L-HKC)组、HKC高剂量(H-HKC)组、硫辛酸(lipoic acid，LA)组各7只。采用单侧肾切除联合2次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立DN模型。造模成功后，HKC组、硫辛酸组大鼠分别经灌胃给予HKC悬浊液(0.75，2 g·kg-1)或硫辛酸(60 mg·kg-1)，模型组大鼠也同时经灌胃给予2 mL蒸馏水，每天1次，连续8周。各组大鼠自给药开始计时，第8周末处死，采集血液和肾组织，观察HKC对尿白蛋白、肾功能、肾纤维化形态特征以及氧化应激(oxidative stress，OS)相关指标、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路关键信号分子、致纤维化细胞因子以及炎症因子蛋白表达水平的影响。结果：HKC改善模型鼠一般情况、体重、尿白蛋白(urinary albumin，UAlb)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)、白蛋白(albumin，Alb)，其效果与硫辛酸相仿；HKC改善模型鼠肾纤维化，以高剂量HKC效果为显著，而且，其抗纤维化作用优于硫辛酸；HKC改善模型鼠肾组织OS主要指标，其效果与硫辛酸相似；HKC下调模型鼠肾组织磷酸化p38MAPK(phosphorylated-p38MAPK，p-p38MAPK)蛋白表达水平，降低转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α蛋白表达水平，而硫辛酸只能抑制肾组织TNF-α蛋白表达水平。结论：对于DN模型鼠，HKC和硫辛酸一样，在体内具有拮抗肾组织OS损伤的作用；HKC与硫辛酸不一样，通过抑制肾组织p38MAPK信号通路活性以及致纤维化细胞因子、炎症因子蛋白表达水平，改善肾纤维化。
, 百拇医药
[关键词] 糖尿病肾病；黄葵胶囊；氧化应激；磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路；肾纤维化
氧化应激(oxidative stress，OS)诱导肾组织损伤在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制中占有重要地位[1-2]。在生理状态下，适量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产物，如丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)等能迅速被肾组织内酶类抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等清除[3]；在糖尿病状态下，除外多元醇通路激活、蛋白激酶C活化、晚期糖基化终产物增多、葡萄糖氧化磷酸化等经典途径，新近发现的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶及其亚型NOX4和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine，8-OHdG)等因素也会直接导致ROS过多生成，促使肾脏固有细胞发生OS，并且，激活多条信号通路(如p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路等)，促进下游的各种致纤维化细胞因子(如转化生长因子-β等)、炎症因子(如肿瘤坏死因子-α等)基因转录和蛋白表达，最终，出现细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积而形成肾纤维化[4-5]。因此，笔者推测，通过减轻DN肾组织OS损伤，就有可能改善肾纤维化，延缓DN进展。
, http://www.100md.com
黄蜀葵花是锦葵科秋葵属植物黄蜀葵[Abelmoschus manihot(L.)medic，AM]的花朵，具有“清热除湿、消肿解毒”的功效(《嘉祐本草》)。近20年来，我国学者自主研制的AM提取物制剂——黄葵胶囊(Huangkui capsule，HKC)已经在临床上被广泛地应用于治疗DN[6-8]。实践表明，HKC可以减少早、中期DN患者蛋白尿，改善肾功能，其机制可能是通过改善肾纤维化、保护肾小管损伤等途径来实现的[9]。然而，迄今为止，基于DN肾组织OS损伤机制的药理研究还相当匮乏。近年来，硫辛酸(lipoic acid，LA)在欧洲作为一种超强型的抗氧化剂被广泛用于糖尿病神经病变的临床治疗[10]。据报道[11]，对于链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病模型鼠，硫辛酸可以通过抗OS而减轻白蛋白尿和肾脏病理性损害。因此，笔者借助STZ诱导的DN模型鼠，以硫辛酸为对照，试图揭示HKC在体内改善DN肾纤维化的作用和机制。
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1 材料
1.1 动物 33只体重170 g，8周龄左右的SPF级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，购自南京军区总院动物中心(批号：南京军区总院动物中心slxk 2012-11)，在南京大学医学院附属鼓楼医院(简称“鼓楼医院”)动物实验中心喂养。所有大鼠给予标准饲料，并自由饮水。大鼠购回后适应性喂养1周。
1.2 药物与试剂 HKC(国药准字Z19990040)购自江苏苏中制药有限公司；硫辛酸(国药准字H20100153)购自山东齐鲁药业有限公司。STZ购自Sigma公司；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自凯基公司；兔抗大鼠转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1多克隆抗体、小鼠抗大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α单克隆抗体、兔抗大鼠NOX4多克隆抗体购自Abcam 公司；兔抗大鼠磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠多克隆抗体β-actin购自Bioworld公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自Abcam 公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自联科公司。, 百拇医药(毛志敏 万毅刚 孙伟 陈好利 黄燕如 史喜苗 姚建)
, 百拇医药
[关键词] 糖尿病肾病；黄葵胶囊；氧化应激；磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路；肾纤维化
氧化应激(oxidative stress，OS)诱导肾组织损伤在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制中占有重要地位[1-2]。在生理状态下，适量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产物，如丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)等能迅速被肾组织内酶类抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等清除[3]；在糖尿病状态下，除外多元醇通路激活、蛋白激酶C活化、晚期糖基化终产物增多、葡萄糖氧化磷酸化等经典途径，新近发现的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶及其亚型NOX4和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine，8-OHdG)等因素也会直接导致ROS过多生成，促使肾脏固有细胞发生OS，并且，激活多条信号通路(如p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路等)，促进下游的各种致纤维化细胞因子(如转化生长因子-β等)、炎症因子(如肿瘤坏死因子-α等)基因转录和蛋白表达，最终，出现细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积而形成肾纤维化[4-5]。因此，笔者推测，通过减轻DN肾组织OS损伤，就有可能改善肾纤维化，延缓DN进展。
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黄蜀葵花是锦葵科秋葵属植物黄蜀葵[Abelmoschus manihot(L.)medic，AM]的花朵，具有“清热除湿、消肿解毒”的功效(《嘉祐本草》)。近20年来，我国学者自主研制的AM提取物制剂——黄葵胶囊(Huangkui capsule，HKC)已经在临床上被广泛地应用于治疗DN[6-8]。实践表明，HKC可以减少早、中期DN患者蛋白尿，改善肾功能，其机制可能是通过改善肾纤维化、保护肾小管损伤等途径来实现的[9]。然而，迄今为止，基于DN肾组织OS损伤机制的药理研究还相当匮乏。近年来，硫辛酸(lipoic acid，LA)在欧洲作为一种超强型的抗氧化剂被广泛用于糖尿病神经病变的临床治疗[10]。据报道[11]，对于链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病模型鼠，硫辛酸可以通过抗OS而减轻白蛋白尿和肾脏病理性损害。因此，笔者借助STZ诱导的DN模型鼠，以硫辛酸为对照，试图揭示HKC在体内改善DN肾纤维化的作用和机制。
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1 材料
1.1 动物 33只体重170 g，8周龄左右的SPF级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，购自南京军区总院动物中心(批号：南京军区总院动物中心slxk 2012-11)，在南京大学医学院附属鼓楼医院(简称“鼓楼医院”)动物实验中心喂养。所有大鼠给予标准饲料，并自由饮水。大鼠购回后适应性喂养1周。
1.2 药物与试剂 HKC(国药准字Z19990040)购自江苏苏中制药有限公司；硫辛酸(国药准字H20100153)购自山东齐鲁药业有限公司。STZ购自Sigma公司；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自凯基公司；兔抗大鼠转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1多克隆抗体、小鼠抗大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α单克隆抗体、兔抗大鼠NOX4多克隆抗体购自Abcam 公司；兔抗大鼠磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠多克隆抗体β-actin购自Bioworld公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购自Abcam 公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自联科公司。, 百拇医药(毛志敏 万毅刚 孙伟 陈好利 黄燕如 史喜苗 姚建)