虫草素调控eIF2α/TGF—β/Smad信号通路改善肾间质纤维化的机制(1)
[摘要] 目的：观察冬虫夏草主要有效成分——虫草素(cordycepin)对肾间质纤维化及其eIF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制。方法：将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组，建立小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾间质纤维化模型，虫草素组小鼠经皮下注射虫草素(5 mg·kg-1·d-1)，同时，以生理盐水干预对照组和模型组，共5 d。实验结束后，取小鼠结扎侧的肾脏，观察肾间质纤维化病理特征，并测定肾组织I型胶原(collagen type I，Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)核酸表达(Northern blot)；另外，在体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)，在转化生长因子(transforming growth factor，TGF)- β联合或不联合虫草素干预后，观察I型胶原、IV型胶原(collagen type IV，Col IV)核酸表达的变化(Northern blot)，并检测eIF2α、磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3)蛋白表达的变化(Western blot)。结果：虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化，包括纤维化的病理特征以及I型胶原、α-SMA核酸的表达；虫草素在体外促进NRK-52E细胞p-eIF2α的高表达，抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及I型、IV型胶原的表达水平。结论：虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用，它可能是通过诱导eIF2α磷酸化，抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达，减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。
, 百拇医药
[关键词] 虫草素；肾间质纤维化；eIF2α/TGF-β/Smad信号通路
肾间质纤维化是各类慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)发展至终末期肾病的基本环节[1]。目前，冬虫夏草(cordyceps militaris)及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种CKD，而且，对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。研究表明，冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3]，还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、IV型胶原(collagen type IV，Col IV)的表达[4-5]。虫草素(cordycepin)是冬虫夏草的主要有效成分[6]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。据报道[9]，虫草素可抑制TGF-β信号及其诱导的α-SMA和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)合成。然而，虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。
, http://www.100md.com
真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIF)2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸(trasfer RNA，tRNA)与核糖体的结合，它是核酸翻译的关键调控因子之一。激活eIF2α可抑制eIF2β亚单位活性，影响eIF2-GTP形成，进而引起核酸翻译受阻[10]。据报道，在水貂的肺上皮细胞(Mv1Lu细胞)中，过度表达的eIF2α可以直接抑制TGF-β的应答，干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11]；笔者既往研究[12]表明，虫草素可促进eIF2α磷酸化。因此，笔者推测，虫草素可能通过活化eIF2α信号，引起翻译抑制，发挥调控Smad信号通路活性的作用。在本课题中，笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾间质纤维化模型的干预作用；其次，通过体外实验，观察虫草素对肾小管上皮细胞eIF2α磷酸化及TGF-β/Smad信号通路的影响，最终，揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。
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1 材料
1.1 动物 体重约20 g的C57BL/6雄性小鼠(SPF)购自并饲养于日本山梨大学(University of Yamanashi)动物实验中心。所有小鼠均给予标准饮食，并自由饮水。小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。
1.2 药物与试剂 虫草素购自Sigma-Aldrich公司，重组TGF-β购自R&D System公司。抗总eIF2α抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)抗体、抗α-SMA抗体、抗磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3)抗体、抗Smad2/3抗体、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的相应二抗均购自于Cell Signaling公司。总RNA提取试剂盒购自Promega公司。
2 方法
2.1 肾间质纤维化模型制作 参照Chevalier的方法[13]进行UUO手术。小鼠经麻醉后分离左侧输尿管，以0号丝线在2处不同部位完全结扎；对照组仅接受麻醉、打开腹腔并分离左侧输尿管，但不进行结扎操作。, 百拇医药(顾刘宝 卞茸文 涂玥 胡浩 万毅刚 孙伟)
, 百拇医药
[关键词] 虫草素；肾间质纤维化；eIF2α/TGF-β/Smad信号通路
肾间质纤维化是各类慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)发展至终末期肾病的基本环节[1]。目前，冬虫夏草(cordyceps militaris)及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种CKD，而且，对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。研究表明，冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3]，还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、IV型胶原(collagen type IV，Col IV)的表达[4-5]。虫草素(cordycepin)是冬虫夏草的主要有效成分[6]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。据报道[9]，虫草素可抑制TGF-β信号及其诱导的α-SMA和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)合成。然而，虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。
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真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIF)2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸(trasfer RNA，tRNA)与核糖体的结合，它是核酸翻译的关键调控因子之一。激活eIF2α可抑制eIF2β亚单位活性，影响eIF2-GTP形成，进而引起核酸翻译受阻[10]。据报道，在水貂的肺上皮细胞(Mv1Lu细胞)中，过度表达的eIF2α可以直接抑制TGF-β的应答，干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11]；笔者既往研究[12]表明，虫草素可促进eIF2α磷酸化。因此，笔者推测，虫草素可能通过活化eIF2α信号，引起翻译抑制，发挥调控Smad信号通路活性的作用。在本课题中，笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾间质纤维化模型的干预作用；其次，通过体外实验，观察虫草素对肾小管上皮细胞eIF2α磷酸化及TGF-β/Smad信号通路的影响，最终，揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。
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1 材料
1.1 动物 体重约20 g的C57BL/6雄性小鼠(SPF)购自并饲养于日本山梨大学(University of Yamanashi)动物实验中心。所有小鼠均给予标准饮食，并自由饮水。小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。
1.2 药物与试剂 虫草素购自Sigma-Aldrich公司，重组TGF-β购自R&D System公司。抗总eIF2α抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)抗体、抗α-SMA抗体、抗磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3)抗体、抗Smad2/3抗体、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的相应二抗均购自于Cell Signaling公司。总RNA提取试剂盒购自Promega公司。
2 方法
2.1 肾间质纤维化模型制作 参照Chevalier的方法[13]进行UUO手术。小鼠经麻醉后分离左侧输尿管，以0号丝线在2处不同部位完全结扎；对照组仅接受麻醉、打开腹腔并分离左侧输尿管，但不进行结扎操作。, 百拇医药(顾刘宝 卞茸文 涂玥 胡浩 万毅刚 孙伟)