益气清瘟解毒合剂所含益气法中药抗流感免疫炎性损伤的机制(1)
[摘要] 目的：通过动态观察益气清瘟解毒合剂中所含益气法中药对流感病毒感染小鼠肺中炎性细胞因子mRNA的表达及肺组织病理损伤的影响，探讨益气法中药抗流感病毒感染所致小鼠肺组织免疫炎性损伤的机制。方法：在流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株FM1感染小鼠后的不同时相，采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法动态观察益气清瘟解毒合剂中所含益气法中药对小鼠肺中TNF-α，IL-1，IL-6，IL-10，IFN-γ等5种炎性细胞因子mRNA表达的影响，并观察经益气法中药干预后小鼠病毒性肺炎肺组织病理损伤的改变。结果：①益气法中药在FM1感染后第1～5天显著降低小鼠肺中TNF-α mRNA的表达，在感染后第7天明显降低小鼠肺中IL-1 mRNA的表达，在感染后第3天可能升高小鼠肺中IL-1 mRNA的表达，在感染后第3～7天明显降低小鼠肺中IL-6 mRNA的表达，在感染后第3～7天显著升高IL-10 mRNA的表达，在感染后第1天显著升高IFN-γ mRNA的表达。②益气法中药能够显著抑制并修复FM1感染所致小鼠肺组织免疫炎性损伤，其作用在流感病毒FM1感染后第3～7天最为突出。结论：益气清瘟解毒合剂中所含益气法中药可能通过调节流感病毒感染机体失控的炎性细胞因子的基因表达，对抗肺组织的流感免疫炎性损伤，并促进炎性损伤的修复。
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[关键词]益气清瘟解毒合剂；益气法；流感；炎性损伤；机制
2009年在世界范围内新型甲型H1N1流行性性感冒(简称流感)广泛流行期间曾出现不少重症病例。2013年我国首次出现人感染H7N9禽流感病毒的患者，且出现死亡病例。研究表明，流感重症病例的高危人群主要为老年人、年幼儿童、孕产妇或有慢性基础疾病者[1]。炎性细胞因子在流感重症的发生过程中起到了非常关键的作用——炎性细胞因子的过度分泌可引起或加重流感病毒感染机体靶器官的免疫炎性损伤，导致广泛肺组织水肿，急性支气管肺炎的肺泡出血，血管内皮损伤等，进而导致脏器功能衰竭而死亡[2-3]。新型流感病毒的出现严重危害了人类的健康。流感的防治仍然是目前人类面临的主要的公共健康问题之一[1]。
益气清瘟解毒合剂是本院防治流感的效方，在近年来流感的防治中取得了令人满意的疗效。前期研究中发现该方能够显著降低流感患者血清中TNF-α的含量，具有一定的免疫调节作用[4]。该方所含有的益气法代表中药生黄芪具有扶助正气，将时疫毒邪透达于外，从而防止流感的传变，“安未受邪之地”。这有利于减少流感重症的发生。本课题拟进一步揭示益气清瘟解毒合剂所含益气法中药生黄芪抗流感免疫炎性损伤的最佳作用时间点，探讨其治疗流感病毒感染所致肺炎的作用机制。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药物与试剂
益气法代表中药由生黄芪10 g组成，此剂量为益气清瘟解毒合剂中所含有的益气法中药生黄芪的成人临床用量，采用免煎颗粒剂，由江苏天江药业有限公司提供，用去离子水配成混悬液备用。DEPC，TRIzol，Taq DNA Ploymerase、氯仿、异丙醇、乙醇、反转录试剂盒、琼脂糖、溴化乙啶，100 bp DNA Ladder。
1.2 病毒
流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株FM1由中国疾病预防控制中心病毒研究所流感室提供，鸡胚传代后，血凝滴度为1∶1 280，-70 ℃冻存备用。
1.3 动物
BALB/cAnN小白鼠，清洁级，雄性，体重18～23 g，共96只，购自中国医学科学院动物所。合格证号SCXK(京)2004-0001。
, 百拇医药
1.4 仪器
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪(Singapore)；Gel Doc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；TFX紫外透射仪(法国Vilber Lourmat公司)；MilliQ纯水仪；IX71光学显微镜(奥林巴斯光学有限公司)；JEM-1230透射电镜(日本电子株式会社)。
2 方法
2.1 动物实验
2.1.1 感染方法 将小鼠随机分为3组，分别为正常空白组、病毒感染模型组、益气法中药组，各组按病毒感染后第1，3，5，7天不同时相各分为4个小组，每小组8只小鼠，共96只。用乙醚轻度麻醉小鼠后，正常空白组以生理盐水滴鼻，每只25 μL。其余各组以25 μL FM1株病毒液滴鼻，感染量为1LD50。
, 百拇医药
2.1.2 给药 小鼠感染FM1半小时后开始给药。每次给药前均称小鼠体重，根据小鼠体重确定用药量。益气法中药组灌服中药混悬液，相当于成人临床用药剂量，即1.30 g·kg-1·d-1，正常组与模型组灌等量生理盐水，每日灌胃1次。
2.1.3 流感病毒FM1感染所致小鼠病毒性肺炎肺组织病理改变的观察方法 小鼠感染流感病毒FM1后第1，3，5，7天，摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，肉眼观察记录肺部大体病变情况。制作各组小鼠苏木素-伊红染色(HE染色)病理切片，在光学显微镜下对比观察各组动物肺组织病变的情况。取全部3组小鼠的肺组织制作醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色超薄病理切片，透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。
2.2 肺组织RNA提取
以提取TNF-α的RNA为例。
2.2.1 肺组织提取 分别于感染后第1，3，5，7天摘眼球放血处死小鼠，留取各小组小鼠新鲜肺组织50～100 mg，放入无RNA酶的离心管中，用液氮迅速冷冻后，放入-70 ℃冻存备用。, 百拇医药(徐红日 王成祥 王兰 周平安 殷人易 姜良铎 王惠芳)
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[关键词]益气清瘟解毒合剂；益气法；流感；炎性损伤；机制
2009年在世界范围内新型甲型H1N1流行性性感冒(简称流感)广泛流行期间曾出现不少重症病例。2013年我国首次出现人感染H7N9禽流感病毒的患者，且出现死亡病例。研究表明，流感重症病例的高危人群主要为老年人、年幼儿童、孕产妇或有慢性基础疾病者[1]。炎性细胞因子在流感重症的发生过程中起到了非常关键的作用——炎性细胞因子的过度分泌可引起或加重流感病毒感染机体靶器官的免疫炎性损伤，导致广泛肺组织水肿，急性支气管肺炎的肺泡出血，血管内皮损伤等，进而导致脏器功能衰竭而死亡[2-3]。新型流感病毒的出现严重危害了人类的健康。流感的防治仍然是目前人类面临的主要的公共健康问题之一[1]。
益气清瘟解毒合剂是本院防治流感的效方，在近年来流感的防治中取得了令人满意的疗效。前期研究中发现该方能够显著降低流感患者血清中TNF-α的含量，具有一定的免疫调节作用[4]。该方所含有的益气法代表中药生黄芪具有扶助正气，将时疫毒邪透达于外，从而防止流感的传变，“安未受邪之地”。这有利于减少流感重症的发生。本课题拟进一步揭示益气清瘟解毒合剂所含益气法中药生黄芪抗流感免疫炎性损伤的最佳作用时间点，探讨其治疗流感病毒感染所致肺炎的作用机制。
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1 材料
1.1 药物与试剂
益气法代表中药由生黄芪10 g组成，此剂量为益气清瘟解毒合剂中所含有的益气法中药生黄芪的成人临床用量，采用免煎颗粒剂，由江苏天江药业有限公司提供，用去离子水配成混悬液备用。DEPC，TRIzol，Taq DNA Ploymerase、氯仿、异丙醇、乙醇、反转录试剂盒、琼脂糖、溴化乙啶，100 bp DNA Ladder。
1.2 病毒
流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株FM1由中国疾病预防控制中心病毒研究所流感室提供，鸡胚传代后，血凝滴度为1∶1 280，-70 ℃冻存备用。
1.3 动物
BALB/cAnN小白鼠，清洁级，雄性，体重18～23 g，共96只，购自中国医学科学院动物所。合格证号SCXK(京)2004-0001。
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1.4 仪器
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪(Singapore)；Gel Doc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；TFX紫外透射仪(法国Vilber Lourmat公司)；MilliQ纯水仪；IX71光学显微镜(奥林巴斯光学有限公司)；JEM-1230透射电镜(日本电子株式会社)。
2 方法
2.1 动物实验
2.1.1 感染方法 将小鼠随机分为3组，分别为正常空白组、病毒感染模型组、益气法中药组，各组按病毒感染后第1，3，5，7天不同时相各分为4个小组，每小组8只小鼠，共96只。用乙醚轻度麻醉小鼠后，正常空白组以生理盐水滴鼻，每只25 μL。其余各组以25 μL FM1株病毒液滴鼻，感染量为1LD50。
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2.1.2 给药 小鼠感染FM1半小时后开始给药。每次给药前均称小鼠体重，根据小鼠体重确定用药量。益气法中药组灌服中药混悬液，相当于成人临床用药剂量，即1.30 g·kg-1·d-1，正常组与模型组灌等量生理盐水，每日灌胃1次。
2.1.3 流感病毒FM1感染所致小鼠病毒性肺炎肺组织病理改变的观察方法 小鼠感染流感病毒FM1后第1，3，5，7天，摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，肉眼观察记录肺部大体病变情况。制作各组小鼠苏木素-伊红染色(HE染色)病理切片，在光学显微镜下对比观察各组动物肺组织病变的情况。取全部3组小鼠的肺组织制作醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色超薄病理切片，透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。
2.2 肺组织RNA提取
以提取TNF-α的RNA为例。
2.2.1 肺组织提取 分别于感染后第1，3，5，7天摘眼球放血处死小鼠，留取各小组小鼠新鲜肺组织50～100 mg，放入无RNA酶的离心管中，用液氮迅速冷冻后，放入-70 ℃冻存备用。, 百拇医药(徐红日 王成祥 王兰 周平安 殷人易 姜良铎 王惠芳)