构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素(1)
[摘要]为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂，本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因CrtB和CrtI，获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000。在此基础上，在工程菌ZD-L-000中分别过表达MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20，以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因SaGGPS，考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响，结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量，但过表达tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS基因均能显著提高番茄红素的产量，分别为初始菌株的2.0，16.9和 20.5倍。在进一步研究中，tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000，获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍，达到 13.23 mg·L-1；在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1 (提高10.2倍)。本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础。
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[关键词]番茄红素；酿酒酵母；合成生物学；甲羟戊酸途径
番茄红素(Lycopene)是一种抗氧化活性很强的功能性天然色素，在癌症预防，抗衰老和增强机体免疫力等方面有广泛应用，市场巨大[1]。目前主要在番茄中直接提取，或利用三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora、欧文氏菌Erwinia uredovora和成团泛菌Pantoea agglomerans等野生微生物来发酵生产番茄红素[1]。然而直接提取法存在的资源依赖和环境破坏，野生微生物菌种性能差、产量低、难以工业化生产等问题影响番茄红素的生产[2]。通过发掘目标化合物生物合成途径的关键基因，利用合成生物学技术，设计和改造微生物菌株来生产天然产物被认为是一种最有潜力的资源获取方法[3-5]。
自然界中萜类基本单元异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)生物合成途径有两条：在真菌和植物细胞胞液/内质网上，由乙酰CoA经甲羟戊酸(MVA)途径合成；在细菌与植物质体中由丙酮酸与3-磷酸甘油醛经2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成[3，6]。在番茄红素生物合成途径中，IPP和DMAPP这两个萜类单元能被法呢烯焦磷酸合酶(FPS)和牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)依次催化得到二萜类的通用前体牻牛儿基焦磷酸(GGPP)；GGPP能继续被八氢番茄红素合成酶(CrtB基因编码)和八氢番茄红素去饱和酶(CrtI基因编码)催化形成番茄红素(图1)[7，8]。安全模式微生物酿酒酵母中存在高效合成萜类的MVA途径，在前人的研究中，酿酒酵母已被成功改造为生产青蒿酸[5，9]、丹参酮[10-11]和人参皂苷[12-13]等多种药用萜类化合物的工程菌，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂具有很大潜力。
, 百拇医药
前期研究中，Yamano等将欧文氏菌的番茄红素合成基因引入到酿酒酵母中获得了产量为113 μg·g-1细胞干重的番茄红素工程菌[8]。为进一步获得高产番茄红素酿酒酵母工程菌，在本研究中，首先在酿酒酵母中引入来源于活性较高的成团泛菌番茄红素合成酶基因CrtB和CrtI[7]，构建出番茄红素的合成途径。在探索萜类生物合成途径中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、萜类相关的转录因子编码基因upc2.1、GGPS与FPS融合酶编码基因BTS1-ERG20，以及来自嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的GGPS编码基因SaGGPS等关键遗传因子对番茄红素合成影响的基础上，进一步将有利于提高番茄红素产量的基因一同整合到酵母基因组上获得高产菌株，为构建高产番茄红素的酿酒酵母工程菌提供了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 工具酶与试剂 PrimeSTAR HS DNA聚合酶(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自大连宝生物工程公司；限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ购自 Fermentas公司； 快连酶购自NEB公司； 质粒小量快速提取试剂盒购自美国 Axygen公司；酵母DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA回收试剂盒购自美国 Biomiga公司；氨苄青霉素、潮霉素、G418购自上海生工生物工程有限公司；酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)购自北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司；番茄红素标品购自美国 Sigma-Aldrich 公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 PCR扩增仪，Eppendorf Mastercycler gradient；全自动凝胶成像系统，BIO-RAD Molecular Imager Gel DOC XR；台式高速离心机，Eppendorf 5415D； 紫外可见分光光度计，Shimadzu UV-2550； 高速冷冻离心机，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色谱，Agilent Technologies Series 1260。
1.1.3 菌株、引物和质粒 本次研究所用菌株，引物和质粒已经分别在表1～3中列出。
1.1.4 培养基 LB 培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠；SM-URA筛选培养基：0.8%酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2%葡萄糖，0.01%His.，0.01%Trp.，0.01% Leu.；SM-LEU-URA筛选培养基：0.8%酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2%葡萄糖，0.01%Trp.，0.01% His.；YPD培养基：2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖；无机盐培养基：按文献配制[14]，用于酵母的高密度发酵。, 百拇医药(施明雨 刘怡 王冬 路福平 黄璐琦 戴住波 张学礼)
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[关键词]番茄红素；酿酒酵母；合成生物学；甲羟戊酸途径
番茄红素(Lycopene)是一种抗氧化活性很强的功能性天然色素，在癌症预防，抗衰老和增强机体免疫力等方面有广泛应用，市场巨大[1]。目前主要在番茄中直接提取，或利用三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora、欧文氏菌Erwinia uredovora和成团泛菌Pantoea agglomerans等野生微生物来发酵生产番茄红素[1]。然而直接提取法存在的资源依赖和环境破坏，野生微生物菌种性能差、产量低、难以工业化生产等问题影响番茄红素的生产[2]。通过发掘目标化合物生物合成途径的关键基因，利用合成生物学技术，设计和改造微生物菌株来生产天然产物被认为是一种最有潜力的资源获取方法[3-5]。
自然界中萜类基本单元异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)生物合成途径有两条：在真菌和植物细胞胞液/内质网上，由乙酰CoA经甲羟戊酸(MVA)途径合成；在细菌与植物质体中由丙酮酸与3-磷酸甘油醛经2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成[3，6]。在番茄红素生物合成途径中，IPP和DMAPP这两个萜类单元能被法呢烯焦磷酸合酶(FPS)和牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)依次催化得到二萜类的通用前体牻牛儿基焦磷酸(GGPP)；GGPP能继续被八氢番茄红素合成酶(CrtB基因编码)和八氢番茄红素去饱和酶(CrtI基因编码)催化形成番茄红素(图1)[7，8]。安全模式微生物酿酒酵母中存在高效合成萜类的MVA途径，在前人的研究中，酿酒酵母已被成功改造为生产青蒿酸[5，9]、丹参酮[10-11]和人参皂苷[12-13]等多种药用萜类化合物的工程菌，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂具有很大潜力。
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前期研究中，Yamano等将欧文氏菌的番茄红素合成基因引入到酿酒酵母中获得了产量为113 μg·g-1细胞干重的番茄红素工程菌[8]。为进一步获得高产番茄红素酿酒酵母工程菌，在本研究中，首先在酿酒酵母中引入来源于活性较高的成团泛菌番茄红素合成酶基因CrtB和CrtI[7]，构建出番茄红素的合成途径。在探索萜类生物合成途径中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、萜类相关的转录因子编码基因upc2.1、GGPS与FPS融合酶编码基因BTS1-ERG20，以及来自嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的GGPS编码基因SaGGPS等关键遗传因子对番茄红素合成影响的基础上，进一步将有利于提高番茄红素产量的基因一同整合到酵母基因组上获得高产菌株，为构建高产番茄红素的酿酒酵母工程菌提供了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 工具酶与试剂 PrimeSTAR HS DNA聚合酶(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自大连宝生物工程公司；限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ购自 Fermentas公司； 快连酶购自NEB公司； 质粒小量快速提取试剂盒购自美国 Axygen公司；酵母DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA回收试剂盒购自美国 Biomiga公司；氨苄青霉素、潮霉素、G418购自上海生工生物工程有限公司；酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)购自北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司；番茄红素标品购自美国 Sigma-Aldrich 公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 PCR扩增仪，Eppendorf Mastercycler gradient；全自动凝胶成像系统，BIO-RAD Molecular Imager Gel DOC XR；台式高速离心机，Eppendorf 5415D； 紫外可见分光光度计，Shimadzu UV-2550； 高速冷冻离心机，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色谱，Agilent Technologies Series 1260。
1.1.3 菌株、引物和质粒 本次研究所用菌株，引物和质粒已经分别在表1～3中列出。
1.1.4 培养基 LB 培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠；SM-URA筛选培养基：0.8%酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2%葡萄糖，0.01%His.，0.01%Trp.，0.01% Leu.；SM-LEU-URA筛选培养基：0.8%酵母选择培养基(四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2%葡萄糖，0.01%Trp.，0.01% His.；YPD培养基：2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖；无机盐培养基：按文献配制[14]，用于酵母的高密度发酵。, 百拇医药(施明雨 刘怡 王冬 路福平 黄璐琦 戴住波 张学礼)