内生真菌Penicillium polonicum次生代谢产物研究(1)
[摘要]选用PDB培养基发酵菌株，对内生真菌Penicillium polonicum次生代谢产物进行化学成分研究。结合运用凝胶SephadexLH-20 柱色谱、反相柱色谱和制备HPLC 等多种色谱技术的方法从菌液的乙酸乙酯萃取物中分离鉴定了6个化合物，采用波谱学方法鉴定其结构分别为 [3，5-二羟基-2-(7-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(1)，(3，5-二羟基-2-辛酰)-苯乙酸乙酯(2)，(5，7-二羟基-9-庚基 )-异苯二氢吡喃-3-酮(3)，3-(羟甲基)-4-(1E )-1-丙烯-1-基-( 1R，2S，5R，6S)-7-氧双环[4.1.0]庚-3-烯-2，5-二醇(4)，(E)-2-甲氧基-3-(1-丙烯基)苯酚(5)，对羟基苯乙醇(6)。
[关键词]PDB培养基；内生真菌Penicillium polonicum； 次生代谢产物
目前，内生真菌的研究受到了广泛关注，从中寻找活性成分日益成为研究热点。研究表明，内生真菌次级代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、甾体类、萜类、苯并吡喃和苯并呋喃类、香豆素和异香豆素类、醌类、黄酮类、酚和酚酸类、内酯类、脂肪族化合物、氨基酸和肽类等，而且药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核、抗氧化等作用[1-2]。此外，目前已经从植物内生真菌这一丰富资源中分离并鉴定了诸多有价值的生理活性物质，如紫杉醇、赤霉素、喜树碱、长春新碱等[3]；表明从植物内生真菌代谢产物中寻找有效的药物分子来替代对植物资源开采的可能性。
, 百拇医药
豆科仪花属包括2种植物，即仪花Lysidicie rhodostegia Hance和短萼仪花L. brevicalyx Wei。本课题组曾对仪花L. rhodostegia ——单刀根的化学成分进行了较为系统的研究，从中分离得到间苯三酚、二苯乙烯、黄酮类等酚类成分。同时，本课题组亦从单刀根中分离得到一系列内生真菌，其中内生真菌Penicillium polonicum 菌株显示对多种肿瘤细胞(人结肠癌细胞，人肝癌细胞，人肺癌细胞和人卵巢癌细胞等)均具有抑制活性，IC50范围在2.04～3.95 mg·L-1。因此，本文选择对该菌株的次生代谢产物进行研究。
1 材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 采样植物 采集健康的仪花L. rhodostegia Hance ——单刀根作为分离内生真菌的材料。
, 百拇医药
1.1.2 菌株 单刀根内生真菌经中国科学院微生物所鉴定为P. polonicum。
1.1.3 培养基 实验中所用培养基为PDB 培养基：马铃薯去皮(200 g·L-1)，葡萄糖(25 g·L-1)，蒸馏水( 1 L )。培养基均120～122 ℃ 蒸气灭菌30 min。
1.2 仪器
XGYU 型高压灭菌锅；Perkin-Elmer 343型旋光仪；Agilent 1100 Series 型紫外检测器；Nicolet 5700 型傅立叶变换红外光谱仪；AccuTOF CS(JMS-T100CS，JEOL) 型质谱仪；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL 型质谱仪；Inova 500M 核磁共振仪，SX-600 核磁共振仪；岛津液相色谱仪，Agilent 1100 Series 液相色谱仪：制备型反相色谱柱 YMC-Pack ODS-A(20 mm×250 mm，10 μm)；分析型反相色谱柱 Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。
, 百拇医药
大孔树脂柱(D101 型，天津南开)； 薄层硅胶(硅胶GF254，青岛海洋化工厂生产)；凝胶(SephadexTM LH-20，Amersham Pharmacia Biotech AB)；
反相硅胶[Rp-C18(40～75 μm)，日本Fuji Silysia 公司]；试剂，分析纯(北京化工厂)，色谱纯(天津科密欧公司)。
2 提取分离
配制1.1.3中培养基，于无菌条件下，取新鲜斜面，用无菌接种针钩取小块孢子接入种子培养基中，27 ℃，110 r·min-1摇床上振荡培养72 h。分5次配制共155 L培养基，摇瓶装量为400 mL(1 L三角瓶)。120～122 ℃ 蒸气灭菌30 min。于无菌条件下将种子均匀接种至培养基中，27 ℃，110 r·min-1摇床上振荡培养7 d。收集糊状发酵物，于冰箱冻融处理，纱布过滤分离菌丝体与菌液。菌丝体用95%乙醇浸泡数天后，纱布过滤，菌丝体阴干，滤液并入菌液。菌液上大孔树脂柱，弃水洗部分，回收95%乙醇洗脱部分至无醇，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物39.5 g，正丁醇萃取物52 g。粉碎干燥菌丝体( 958 g )，分别用95% 乙醇和70% 乙醇回流提取，浓缩合并，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物114 g，正丁醇萃取物20.9 g。
, 百拇医药
根据内生真菌P. polonicum发酵菌液各部分萃取物的MTT 活性筛选结果，选择菌液的乙酸乙酯萃取物进行后续分离纯化。依据预试验结果，菌液乙酸乙酯萃取物甲醇溶解，抽滤，滤液经Sephadex LH-20 柱色谱(分次用CH3OH；CH3OH；CH2Cl2-CH3OH 1∶1，洗脱)反复纯化去除色素，得主要组分YE(23.0 g)，进一步经ODS柱色谱(CH3OH-H2O梯度洗脱)纯化得8个组分(YE-1～8)，组分YE-3(1.5 g)，YE-4(2.3 g)，YE-5(0.6 g)，YE-7(0.9 g) 进一步经Sephadex LH-20、ODS柱色谱纯化，最后经HPLC制备得化合物1(43 mg)，2(29 mg)，3(24 mg)，4(40 mg)，5(12 mg)，6(31 mg)。, 百拇医药(刘静 丁广治 方磊 庾石山)
[关键词]PDB培养基；内生真菌Penicillium polonicum； 次生代谢产物
目前，内生真菌的研究受到了广泛关注，从中寻找活性成分日益成为研究热点。研究表明，内生真菌次级代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、甾体类、萜类、苯并吡喃和苯并呋喃类、香豆素和异香豆素类、醌类、黄酮类、酚和酚酸类、内酯类、脂肪族化合物、氨基酸和肽类等，而且药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核、抗氧化等作用[1-2]。此外，目前已经从植物内生真菌这一丰富资源中分离并鉴定了诸多有价值的生理活性物质，如紫杉醇、赤霉素、喜树碱、长春新碱等[3]；表明从植物内生真菌代谢产物中寻找有效的药物分子来替代对植物资源开采的可能性。
, 百拇医药
豆科仪花属包括2种植物，即仪花Lysidicie rhodostegia Hance和短萼仪花L. brevicalyx Wei。本课题组曾对仪花L. rhodostegia ——单刀根的化学成分进行了较为系统的研究，从中分离得到间苯三酚、二苯乙烯、黄酮类等酚类成分。同时，本课题组亦从单刀根中分离得到一系列内生真菌，其中内生真菌Penicillium polonicum 菌株显示对多种肿瘤细胞(人结肠癌细胞，人肝癌细胞，人肺癌细胞和人卵巢癌细胞等)均具有抑制活性，IC50范围在2.04～3.95 mg·L-1。因此，本文选择对该菌株的次生代谢产物进行研究。
1 材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 采样植物 采集健康的仪花L. rhodostegia Hance ——单刀根作为分离内生真菌的材料。
, 百拇医药
1.1.2 菌株 单刀根内生真菌经中国科学院微生物所鉴定为P. polonicum。
1.1.3 培养基 实验中所用培养基为PDB 培养基：马铃薯去皮(200 g·L-1)，葡萄糖(25 g·L-1)，蒸馏水( 1 L )。培养基均120～122 ℃ 蒸气灭菌30 min。
1.2 仪器
XGYU 型高压灭菌锅；Perkin-Elmer 343型旋光仪；Agilent 1100 Series 型紫外检测器；Nicolet 5700 型傅立叶变换红外光谱仪；AccuTOF CS(JMS-T100CS，JEOL) 型质谱仪；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL 型质谱仪；Inova 500M 核磁共振仪，SX-600 核磁共振仪；岛津液相色谱仪，Agilent 1100 Series 液相色谱仪：制备型反相色谱柱 YMC-Pack ODS-A(20 mm×250 mm，10 μm)；分析型反相色谱柱 Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。
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大孔树脂柱(D101 型，天津南开)； 薄层硅胶(硅胶GF254，青岛海洋化工厂生产)；凝胶(SephadexTM LH-20，Amersham Pharmacia Biotech AB)；
反相硅胶[Rp-C18(40～75 μm)，日本Fuji Silysia 公司]；试剂，分析纯(北京化工厂)，色谱纯(天津科密欧公司)。
2 提取分离
配制1.1.3中培养基，于无菌条件下，取新鲜斜面，用无菌接种针钩取小块孢子接入种子培养基中，27 ℃，110 r·min-1摇床上振荡培养72 h。分5次配制共155 L培养基，摇瓶装量为400 mL(1 L三角瓶)。120～122 ℃ 蒸气灭菌30 min。于无菌条件下将种子均匀接种至培养基中，27 ℃，110 r·min-1摇床上振荡培养7 d。收集糊状发酵物，于冰箱冻融处理，纱布过滤分离菌丝体与菌液。菌丝体用95%乙醇浸泡数天后，纱布过滤，菌丝体阴干，滤液并入菌液。菌液上大孔树脂柱，弃水洗部分，回收95%乙醇洗脱部分至无醇，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物39.5 g，正丁醇萃取物52 g。粉碎干燥菌丝体( 958 g )，分别用95% 乙醇和70% 乙醇回流提取，浓缩合并，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物114 g，正丁醇萃取物20.9 g。
, 百拇医药
根据内生真菌P. polonicum发酵菌液各部分萃取物的MTT 活性筛选结果，选择菌液的乙酸乙酯萃取物进行后续分离纯化。依据预试验结果，菌液乙酸乙酯萃取物甲醇溶解，抽滤，滤液经Sephadex LH-20 柱色谱(分次用CH3OH；CH3OH；CH2Cl2-CH3OH 1∶1，洗脱)反复纯化去除色素，得主要组分YE(23.0 g)，进一步经ODS柱色谱(CH3OH-H2O梯度洗脱)纯化得8个组分(YE-1～8)，组分YE-3(1.5 g)，YE-4(2.3 g)，YE-5(0.6 g)，YE-7(0.9 g) 进一步经Sephadex LH-20、ODS柱色谱纯化，最后经HPLC制备得化合物1(43 mg)，2(29 mg)，3(24 mg)，4(40 mg)，5(12 mg)，6(31 mg)。, 百拇医药(刘静 丁广治 方磊 庾石山)