基于液相蛋白芯片的甘草有效成分抑制巨噬细胞细胞因子谱表达的研究(1)
[摘要]采用液相蛋白芯片技术检测了甘草酸和甘草总黄酮对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型表达的23种细胞因子水平的影响。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，分为正常对照组、模型组(1 mg·L-1 LPS)、甘草酸高、中、低剂量组(400，80，16 mg·L-1)、甘草总黄酮高、中、低剂量组(200，40，8 mg·L-1)和地塞米松组(5 mg·L-1)。细胞接种于24孔细胞板培养24 h后，依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS(1 mg·L-1)。20 h后收集各组细胞培养上清液，准备采用液相蛋白芯片技术检测上清液中23种细胞因子的水平。结果显示甘草酸能降低炎症模型产生的白介素类细胞因子IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12(p40)，IL-12(p70)和IL-13、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)共10种细胞因子的表达水平；甘草总黄酮能降低IL-6和Eotaxin 共2种细胞因子的表达水平。提示有效地抑制多种炎症介质的释放、多靶点发挥抗炎效果，减轻系统性炎症反应，是甘草发挥抗炎作用的机制之一。
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[关键词]甘草酸；甘草总黄酮；细胞因子；抗炎
甘草作为常用中药，活性高、作用广，具有显著的抗炎活性[1-3]，临床用于急慢性肝炎、支气管炎、银屑病和艾滋病的治疗[4-8]。其中甘草酸和甘草总黄酮类化合物是其抗炎、抗变应性炎症的主要活性成分，其抗炎作用与减少巨噬细胞炎症介质生成与释放关系密切 [9]。 常规研究技术如ELISA、免疫组化和Western blotting等多针对于个别蛋白质进行研究，对甘草及其有效成分的抗炎作用机制研究虽然很多，但呈现指标分散和局限的特点，缺少对其抗炎作用的系统认识。
液相蛋白芯片技术是在流式细胞技术、ELISA技术和传统芯片技术基础上研发的新型蛋白质研究平台，具有同步性好、特异性强、通量大和准确性高等特性，可高通量检测多种细胞信号分子的表达水平，非常适合于细胞因子表达的系统研究。因此，本研究利用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症细胞模型[10]，应用液相蛋白芯片技术[11]，通过测定甘草酸和甘草总黄酮对该模型细胞因子表达谱的影响，对甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用机制进行了较为系统全面的研究。
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1 材料
甘草酸(纯度为98%，批号ZL201203010A)和甘草总黄酮(纯度为95%，批号ZL201204010A)购自南京泽朗医药科技有限公司、地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司(国药准字H12020514)、脂多糖(Escherichia coli O111：B4，L2630)购自美国Sigma公司、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心、Hyclone南美胎牛血清购自美国Thermo公司、DMEM高糖细胞培养基购自美国Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay购自美国Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统购自美国Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司。
2 方法
2.1 药品配置 甘草酸、甘草总黄酮和脂多糖分别溶于高糖DMEM培养液中，配置成质量浓度均为1 g·L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式过滤器过滤，分装保存于15 mL锥型离心管，以上操作均在超净台中进行。
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2.2 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的高糖DMEM培养液，在37 ℃， 5%CO2的培养箱中培养。每2～3 d换液，取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验。
2.3 细胞分组及处理 将细胞分为正常对照组、模型组(1 mg·L-1 LPS)、甘草酸高中低剂量组(400，80，16 mg·L-1)、甘草总黄酮高中低剂量组(200，40，8 mg·L-1)和地塞米松组(5 mg·L-1)。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，弃去原有培养液，加入适量高糖DMEM培养液，反复轻轻吹打制成每mL含1×105个细胞的单细胞悬液。24孔细胞板每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h。依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS(1 mg·L-1)。20 h后收集各组细胞培养上清液，冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。
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2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统检测细胞因子 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r·min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。依据试剂盒说明，每孔加入50 μL抗细胞因子抗体检测磁珠，洗涤2次，向相应孔板加入缓冲液、标准曲线样品溶液、待检测细胞上清液样品。室温下避光500 r·min-1摇床上孵育30 min，洗涤3次。依次分别加入检测抗体50 μL和Streptavidin-PE荧光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL缓冲液重悬微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统读取各孔荧光强度， 并根据标准品的荧光强度计算出样品中白介素类因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12(p40)，IL-12(p70)，IL-13，IL-17，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、干扰素-γ(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、受调节激活的正常T细胞排泌的因子(RANTES)、小鼠角化细胞源性细胞因子(KC)共23种细胞因子的浓度。, http://www.100md.com(刘钊 钟菊迎 高尔宁 杨鸿)
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[关键词]甘草酸；甘草总黄酮；细胞因子；抗炎
甘草作为常用中药，活性高、作用广，具有显著的抗炎活性[1-3]，临床用于急慢性肝炎、支气管炎、银屑病和艾滋病的治疗[4-8]。其中甘草酸和甘草总黄酮类化合物是其抗炎、抗变应性炎症的主要活性成分，其抗炎作用与减少巨噬细胞炎症介质生成与释放关系密切 [9]。 常规研究技术如ELISA、免疫组化和Western blotting等多针对于个别蛋白质进行研究，对甘草及其有效成分的抗炎作用机制研究虽然很多，但呈现指标分散和局限的特点，缺少对其抗炎作用的系统认识。
液相蛋白芯片技术是在流式细胞技术、ELISA技术和传统芯片技术基础上研发的新型蛋白质研究平台，具有同步性好、特异性强、通量大和准确性高等特性，可高通量检测多种细胞信号分子的表达水平，非常适合于细胞因子表达的系统研究。因此，本研究利用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症细胞模型[10]，应用液相蛋白芯片技术[11]，通过测定甘草酸和甘草总黄酮对该模型细胞因子表达谱的影响，对甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用机制进行了较为系统全面的研究。
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1 材料
甘草酸(纯度为98%，批号ZL201203010A)和甘草总黄酮(纯度为95%，批号ZL201204010A)购自南京泽朗医药科技有限公司、地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司(国药准字H12020514)、脂多糖(Escherichia coli O111：B4，L2630)购自美国Sigma公司、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心、Hyclone南美胎牛血清购自美国Thermo公司、DMEM高糖细胞培养基购自美国Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay购自美国Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统购自美国Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司。
2 方法
2.1 药品配置 甘草酸、甘草总黄酮和脂多糖分别溶于高糖DMEM培养液中，配置成质量浓度均为1 g·L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式过滤器过滤，分装保存于15 mL锥型离心管，以上操作均在超净台中进行。
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2.2 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的高糖DMEM培养液，在37 ℃， 5%CO2的培养箱中培养。每2～3 d换液，取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验。
2.3 细胞分组及处理 将细胞分为正常对照组、模型组(1 mg·L-1 LPS)、甘草酸高中低剂量组(400，80，16 mg·L-1)、甘草总黄酮高中低剂量组(200，40，8 mg·L-1)和地塞米松组(5 mg·L-1)。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，弃去原有培养液，加入适量高糖DMEM培养液，反复轻轻吹打制成每mL含1×105个细胞的单细胞悬液。24孔细胞板每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h。依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS(1 mg·L-1)。20 h后收集各组细胞培养上清液，冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。
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2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统检测细胞因子 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r·min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。依据试剂盒说明，每孔加入50 μL抗细胞因子抗体检测磁珠，洗涤2次，向相应孔板加入缓冲液、标准曲线样品溶液、待检测细胞上清液样品。室温下避光500 r·min-1摇床上孵育30 min，洗涤3次。依次分别加入检测抗体50 μL和Streptavidin-PE荧光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL缓冲液重悬微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统读取各孔荧光强度， 并根据标准品的荧光强度计算出样品中白介素类因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12(p40)，IL-12(p70)，IL-13，IL-17，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、干扰素-γ(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、受调节激活的正常T细胞排泌的因子(RANTES)、小鼠角化细胞源性细胞因子(KC)共23种细胞因子的浓度。, http://www.100md.com(刘钊 钟菊迎 高尔宁 杨鸿)