鼠尾草酚抗乳腺癌细胞增殖活性及其雌激素受体亚型介导和调节机制的研究(1)
[摘要]既往研究已经表明，鼠尾草酚(carnosol)具有一定的抗乳腺癌效应，但其ER亚型特异性调节和介导机制与该物质抑制细胞增殖效应的相关性尚不清楚。该研究利用雌激素受体(ER)阳性乳腺癌T47D细胞观察鼠尾草酚对细胞增殖活性的影响及其雌激素受体α，β亚型特异性介导和调节机制。以ERα和ERβ特异性拮抗剂MPP，PHTPP为工具药，采用MTT细胞增殖实验观察鼠尾草酚对T47D细胞增殖的影响；检测T47D细胞增殖周期的变化。利用Western blot方法检测鼠尾草酚对T47D细胞ERα和ERβ表达情况的影响。研究发现，1×10-5～1×10-7 mol·L-1鼠尾草酚能够显著抑制T47D细胞增殖，该抑制作用可被ERα拮抗剂MPP增强、被ERβ拮抗剂PHTPP减弱；1×10-5，1×10-6 mol·L-1鼠尾草酚可使T47D细胞增殖指数显著下降。Western blot检测结果显示1×10-5，1×10-6 mol·L-1鼠尾草酚可使T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达显著增加，并可明显提高ERα/ERβ。结果表明鼠尾草酚具有抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖的作用，其效应是通过靶细胞雌激素受体，特别是ERβ途径实现的；同时，鼠尾草酚对靶细胞雌激素受体ERα和ERβ亚型的表达及其比例具有调节功能。
, 百拇医药
[关键词]鼠尾草酚；乳腺癌；T47D细胞；细胞增殖；细胞周期；雌激素受体
迷迭香Rosmarinus officinalis L系唇形科迷迭香属植物，长期以来在抗氧化、抗炎、抗癌作用等方面均有较为深入的研究和广泛的应用[1]。近年来的研究发现，迷迭香提取物及迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚(图1)等成分具有抗肿瘤如肺癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]，防止致癌物质在体内的代谢活化[7]、抗血管生成等作用[8]，引起了人们广泛的关注[9]。另有报道也发现迷迭香主要抗氧化成分鼠尾草酚对扩散性大鼠乳腺癌F3II细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均具有增殖抑制活性，且具有良好的选择性，是值得开发的乳腺癌抑制剂[10]。而乳腺癌细胞中ER亚型的数量及其比例是影响ER阳性细胞增殖活性的重要因素，本实验室在既往研究中也已经发现[11]：对ER阳性乳腺癌细胞生长具有明显抑制效应的丹参酮ⅡA就是通过ER途径发挥作用的。本研究拟以ERα和ERβ双阳性乳腺癌T47D细胞为实验材料，对鼠尾草酚抑制乳腺癌细胞生长的效应与其ER亚型特异性介导和调节功能及其相关性进行分析，进一步深入揭示鼠尾草酚抗乳腺癌作用的靶点和机制。
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1 材料
1.1 试剂 DMEM(高糖)、无酚红DMEM(高糖)、胎牛血清、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT-FBS)为Hyclone公司产品；雌二醇(estradiol，E2)，MTT，DMSO，RNase，碘化丙啶(propidium iodide，PI)，氯仿，甲醇为Sigma公司产品；ERα，ERβ抗体为Santa Cruz公司产品；ERα，ERβ特异性拮抗剂MPP，PHTPP为Tocris公司产品；甘氨酸、Tween-20为Amresco公司产品；BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液，苯*****(PMSF)，30%丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，蛋白相对分子质量Marker，三羟甲基氨基甲烷，十二烷基磺酸钠，脱脂奶粉，TEMED，SDS-PAGE 上样缓冲液，ECL超敏发光液为普利莱基因有限公司产品；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP为北京康为世纪生物科技有限公司产品；甲醇为北京化工厂产品。
, 百拇医药
1.2 药物与细胞株 鼠尾草酚在哈佛大学附属Mclean医院天然产物分析实验室提取并进行化学结构鉴定：迷迭香干燥叶100 g磨成粉状，室温丙酮提取3次，提取物减压蒸发后得到的残留物再经二氯甲烷/甲醇梯度硅胶色谱得到鼠尾草酚12 mg，其化学结构经HPLC鉴定，并与NMR数据进行对比验证，确定所提取化合物为鼠尾草酚，且纯度>98%。实验时以DMSO溶解，终浓度为1×10-5 ～1×10-7 mol·L-1。人乳腺癌T47D细胞购自北京协和医学院细胞中心。
1.3 仪器 CO2培养箱(Binder)；酶联免疫检测仪(Epson LX-800)；倒置显微镜(Olympus)；凝胶成像分析仪(Pharmacia)；流式细胞仪。
2 方法
2.1 细胞培养 人乳腺癌T47D细胞，常规培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培养条件为37 ℃，5%CO2，相对饱和湿度。实验开始前4 d将细胞用PBS洗涤2次后，改为在无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
, http://www.100md.com
2.2 MTT细胞增殖试验 T47D细胞传代3次，经无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加入无血清DMEM，以3×103个/孔的细胞密度接种于96孔板内，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含1×10-8 mol·L-1 雌二醇、1×10-5～1×10-7 mol·L-1鼠尾草酚的DMEM培养液中继续培养；在拮抗组中同时加入1×10-8 mol·L-1 MPP或PHTPP；每种受试物均设6个复孔。于48 h后加入MTT(5 g·L-1，15 μL/孔)，继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μL。以DMSO调零，用酶联免疫检测仪在570 nm下测定各孔吸光度(A)，计算平均A和增殖率(proliferation rate， PR)。, 百拇医药(赵丕文 David Yue-Wei LEE Zhongze Ma 孙艳玲 陶仕英)
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[关键词]鼠尾草酚；乳腺癌；T47D细胞；细胞增殖；细胞周期；雌激素受体
迷迭香Rosmarinus officinalis L系唇形科迷迭香属植物，长期以来在抗氧化、抗炎、抗癌作用等方面均有较为深入的研究和广泛的应用[1]。近年来的研究发现，迷迭香提取物及迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚(图1)等成分具有抗肿瘤如肺癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]，防止致癌物质在体内的代谢活化[7]、抗血管生成等作用[8]，引起了人们广泛的关注[9]。另有报道也发现迷迭香主要抗氧化成分鼠尾草酚对扩散性大鼠乳腺癌F3II细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均具有增殖抑制活性，且具有良好的选择性，是值得开发的乳腺癌抑制剂[10]。而乳腺癌细胞中ER亚型的数量及其比例是影响ER阳性细胞增殖活性的重要因素，本实验室在既往研究中也已经发现[11]：对ER阳性乳腺癌细胞生长具有明显抑制效应的丹参酮ⅡA就是通过ER途径发挥作用的。本研究拟以ERα和ERβ双阳性乳腺癌T47D细胞为实验材料，对鼠尾草酚抑制乳腺癌细胞生长的效应与其ER亚型特异性介导和调节功能及其相关性进行分析，进一步深入揭示鼠尾草酚抗乳腺癌作用的靶点和机制。
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1.1 试剂 DMEM(高糖)、无酚红DMEM(高糖)、胎牛血清、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT-FBS)为Hyclone公司产品；雌二醇(estradiol，E2)，MTT，DMSO，RNase，碘化丙啶(propidium iodide，PI)，氯仿，甲醇为Sigma公司产品；ERα，ERβ抗体为Santa Cruz公司产品；ERα，ERβ特异性拮抗剂MPP，PHTPP为Tocris公司产品；甘氨酸、Tween-20为Amresco公司产品；BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液，苯*****(PMSF)，30%丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，蛋白相对分子质量Marker，三羟甲基氨基甲烷，十二烷基磺酸钠，脱脂奶粉，TEMED，SDS-PAGE 上样缓冲液，ECL超敏发光液为普利莱基因有限公司产品；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP为北京康为世纪生物科技有限公司产品；甲醇为北京化工厂产品。
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1.2 药物与细胞株 鼠尾草酚在哈佛大学附属Mclean医院天然产物分析实验室提取并进行化学结构鉴定：迷迭香干燥叶100 g磨成粉状，室温丙酮提取3次，提取物减压蒸发后得到的残留物再经二氯甲烷/甲醇梯度硅胶色谱得到鼠尾草酚12 mg，其化学结构经HPLC鉴定，并与NMR数据进行对比验证，确定所提取化合物为鼠尾草酚，且纯度>98%。实验时以DMSO溶解，终浓度为1×10-5 ～1×10-7 mol·L-1。人乳腺癌T47D细胞购自北京协和医学院细胞中心。
1.3 仪器 CO2培养箱(Binder)；酶联免疫检测仪(Epson LX-800)；倒置显微镜(Olympus)；凝胶成像分析仪(Pharmacia)；流式细胞仪。
2 方法
2.1 细胞培养 人乳腺癌T47D细胞，常规培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培养条件为37 ℃，5%CO2，相对饱和湿度。实验开始前4 d将细胞用PBS洗涤2次后，改为在无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
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2.2 MTT细胞增殖试验 T47D细胞传代3次，经无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加入无血清DMEM，以3×103个/孔的细胞密度接种于96孔板内，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含1×10-8 mol·L-1 雌二醇、1×10-5～1×10-7 mol·L-1鼠尾草酚的DMEM培养液中继续培养；在拮抗组中同时加入1×10-8 mol·L-1 MPP或PHTPP；每种受试物均设6个复孔。于48 h后加入MTT(5 g·L-1，15 μL/孔)，继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μL。以DMSO调零，用酶联免疫检测仪在570 nm下测定各孔吸光度(A)，计算平均A和增殖率(proliferation rate， PR)。, 百拇医药(赵丕文 David Yue-Wei LEE Zhongze Ma 孙艳玲 陶仕英)