颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究(1)
[摘要] 托品烷类生物碱(tropane alkaloids， TAs)是临床上广泛使用的抗胆碱药物，颠茄是药典收录的TAs最主要的商业栽培药源植物。基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因(ODC，ADC，AIH，CPA，SPDS，PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ)UniGene序列的数字表达谱，采用qPCR对其中4个已报道基因(PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ)的表达水平进行验证分析，同时采用HPLC测定不同组织中TAs含量。数字表达谱分析结果表明4个TAs上游合成途径基因(ODC，ADC，AIH，CPA)和2个支路途径基因(SPDS，TRⅡ)在颠茄各器官中均有表达，但在须根中高水平表达；3个TAs合成途径特异的结构基因PMT，CYP80F1和H6H均只在须根中大量表达，主根中其次。qPCR检测PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ的表达结果与数字表达谱基本一致， 但PMT，CYP80F1，H6H在主根中表达量很低。莨菪碱质量分数在嫩茎中最高(3.364 mg·g-1)，幼叶，根，幼果和果萼中其次(分别为1.526，1.598，1.271，1.413 mg·g-1)；东莨菪碱质量分数在果萼中最高(1.003 mg·g-1)，嫩茎和幼叶(分别为0.600，0.601 mg·g-1)中其次；2种生物碱在老茎(莨菪碱0.283 mg·g-1，东莨菪碱0.043 mg·g-1)和老叶(莨菪碱0.313 mg·g-1，东莨菪碱0.080 mg·g-1)中质量分数均为最低。该研究结果表明须根是颠茄TAs 生物合成主要器官，而地上幼嫩组织是TAs主要存贮积累器官，TAs合成后存在转运过程。PMT下游基因均只在须根中表达，筛选颠茄须根的转录组数据库就可能为解决该途径中不清晰的合成步骤和相关转录调控因子提供有力的帮助。
, 百拇医药
[关键词] 颠茄；托品烷生物碱；数字表达谱；qPCR
[收稿日期] 2013-07-01
[基金项目] 教育部新世纪人才支持计划项目(NCET-12-0930)；国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100605)；国家自然科学基金项目(31370333)；重庆市科技攻关项目(CSTC2012GGYYJS80013)；西南大学中央高校基本科研业务费专项(XDJK2013A024)
[通信作者] *廖志华，博士，教授，博士生导师，Tel：(023)68367146，E-mail： zhliao@swu.edu.cn
[作者简介] 强玮，博士研究生，研究方向为植物生物学与生物技术，Tel：(023)68367146，E-mail： qiangwei880311@126.com
, 百拇医药
托品烷类生物碱(tropane alkaloids， TAs)是一类具有巨大医疗价值的抗胆碱药物，广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤[1]。临床上常用的是莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)，其中东莨菪碱毒副作用更弱，药效更强，价格也更昂贵，两者的市场需求均十分巨大[2]。目前TAs 都是从少数茄科TAs资源植物中提取，包括颠茄Atropa belladonna、曼陀罗Datura stramonium和莨菪Hyoscyamus niger，颠茄是东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培药源， 也是药典收录的TAs药源植物[3]。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02%～0.17%(干重)，东莨菪碱含量极低，仅为干重的0.01%～0.08%。因此，培育TAs高产颠茄一直是该行业长期追求的目标[2，4-5]。
随着对烟草、曼陀罗、莨菪等相关生物碱模式植物研究的深入，托品烷类生物碱合成途径已基本清晰(图1)。TAs生物合成以鸟氨酸和精氨酸为前体，分别经鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，OrnDC)直接脱羧或精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase，ArgDC)、精胺亚胺基水解酶(agmatine iminohydrolase， AIH)、N-甲氨酰基腐胺氨基水解酶(N-carbamoylputrescine amidohydrolase， CPA)的三步反应最终都形成腐胺。N-甲基-腐胺-转移酶(putrescine N-methyltransferase，PMT)与多胺合成途径的亚精胺合成酶(spermidine synthase， SPDS)竞争腐胺前体生成N-甲基-腐胺，将腐胺流从多胺代谢转向TAs合成，是TAs合成途径上的第一个限速步骤[6]。 N-甲基-腐胺经过一系列酶促和自发反应过程最终生成具有托品环结构的托品酮，托品酮继而被还原生成托品，然后与来源于苯丙氨酸的苯乳酸缩合生成海螺碱。从海螺碱到莨菪碱涉及到多步分子重排反应，CYP80F1是从莨菪中鉴定出来的参与其中反应的一个细胞色素家族基因[7]。莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase，H6H)催化莨菪碱羟基化及环化两步反应，最终生成东莨菪碱，这也是东莨菪碱生物合成途径上最后一个限速步骤[8]。在TAs生物合成中，托品酮还原酶Ⅱ(tropinone reductase Ⅱ， TRⅡ)催化托品酮还原成假托品是最大的一个竞争支路途径，因为在野生颠茄中，该途径终产物打碗花精含量约是TAs的2倍[9]。
*.本文分析9个基因；实线箭头表示单一酶促反应步骤；虚线箭头表示多步酶促反应步骤。
图1 植物体内托品烷类生物碱生物合成途径
Fig.1 The biosynthetic pathway of TAs in planta, http://www.100md.com(强玮 王亚雄 张巧卓 李金弟 夏科 吴能表 廖志华)
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[关键词] 颠茄；托品烷生物碱；数字表达谱；qPCR
[收稿日期] 2013-07-01
[基金项目] 教育部新世纪人才支持计划项目(NCET-12-0930)；国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100605)；国家自然科学基金项目(31370333)；重庆市科技攻关项目(CSTC2012GGYYJS80013)；西南大学中央高校基本科研业务费专项(XDJK2013A024)
[通信作者] *廖志华，博士，教授，博士生导师，Tel：(023)68367146，E-mail： zhliao@swu.edu.cn
[作者简介] 强玮，博士研究生，研究方向为植物生物学与生物技术，Tel：(023)68367146，E-mail： qiangwei880311@126.com
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托品烷类生物碱(tropane alkaloids， TAs)是一类具有巨大医疗价值的抗胆碱药物，广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤[1]。临床上常用的是莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)，其中东莨菪碱毒副作用更弱，药效更强，价格也更昂贵，两者的市场需求均十分巨大[2]。目前TAs 都是从少数茄科TAs资源植物中提取，包括颠茄Atropa belladonna、曼陀罗Datura stramonium和莨菪Hyoscyamus niger，颠茄是东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培药源， 也是药典收录的TAs药源植物[3]。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02%～0.17%(干重)，东莨菪碱含量极低，仅为干重的0.01%～0.08%。因此，培育TAs高产颠茄一直是该行业长期追求的目标[2，4-5]。
随着对烟草、曼陀罗、莨菪等相关生物碱模式植物研究的深入，托品烷类生物碱合成途径已基本清晰(图1)。TAs生物合成以鸟氨酸和精氨酸为前体，分别经鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，OrnDC)直接脱羧或精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase，ArgDC)、精胺亚胺基水解酶(agmatine iminohydrolase， AIH)、N-甲氨酰基腐胺氨基水解酶(N-carbamoylputrescine amidohydrolase， CPA)的三步反应最终都形成腐胺。N-甲基-腐胺-转移酶(putrescine N-methyltransferase，PMT)与多胺合成途径的亚精胺合成酶(spermidine synthase， SPDS)竞争腐胺前体生成N-甲基-腐胺，将腐胺流从多胺代谢转向TAs合成，是TAs合成途径上的第一个限速步骤[6]。 N-甲基-腐胺经过一系列酶促和自发反应过程最终生成具有托品环结构的托品酮，托品酮继而被还原生成托品，然后与来源于苯丙氨酸的苯乳酸缩合生成海螺碱。从海螺碱到莨菪碱涉及到多步分子重排反应，CYP80F1是从莨菪中鉴定出来的参与其中反应的一个细胞色素家族基因[7]。莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase，H6H)催化莨菪碱羟基化及环化两步反应，最终生成东莨菪碱，这也是东莨菪碱生物合成途径上最后一个限速步骤[8]。在TAs生物合成中，托品酮还原酶Ⅱ(tropinone reductase Ⅱ， TRⅡ)催化托品酮还原成假托品是最大的一个竞争支路途径，因为在野生颠茄中，该途径终产物打碗花精含量约是TAs的2倍[9]。
*.本文分析9个基因；实线箭头表示单一酶促反应步骤；虚线箭头表示多步酶促反应步骤。
图1 植物体内托品烷类生物碱生物合成途径
Fig.1 The biosynthetic pathway of TAs in planta, http://www.100md.com(强玮 王亚雄 张巧卓 李金弟 夏科 吴能表 廖志华)