石榴皮、石榴瓤及石榴籽的化学成分比较研究(1)
[摘要] 为比较石榴皮、石榴内瓤和石榴籽化学成分的差异，研究建立了石榴皮饮片的HPLC指纹图谱，对三者的化学成分进行了比较，并对没食子酸和鞣花酸含量进行测定。结果表明，HPLC图谱可见石榴皮与石榴瓤之间化学成分无明显差别，仅成分含量有所不同，而石榴籽与其他二者化学成分存在较大的差异。石榴皮中没食子酸和鞣花酸的质量分数分别为0.33%，0.59%，石榴瓤中没食子酸和鞣花酸的质量分数分别为0.52%，0.38%。石榴籽中仅检测到鞣花酸，质量分数为0.01%。由此可见，在石榴皮饮片净制过程中应去净石榴籽，以免影响饮片质量和临床疗效。内瓤在保证充分干燥的前提下，可以保留。
[关键词] 石榴皮；石榴瓤；石榴籽；HPLC指纹图谱；没食子酸；鞣花酸
石榴皮始载于《雷公炮炙论》，为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，具有涩肠止泻、止血、驱虫等功效，是临床常用的传统中药之一。石榴皮约占到石榴质量的20%～30%[1]，石榴皮饮片的制备方法，2010年版《中国药典》描述如下“除去杂质，洗净，切块，干燥”[2]。《全国中药炮制规范》中要求“除去杂质，去净残留的内瓤及种子，洗净，切块，干燥，或洗净，干燥后捣碎”[3]。然而在对市场销售的石榴皮饮片调研中发现，市售石榴皮饮片中往往都含有大量石榴瓤和石榴籽，有一些样品中瓤和籽的量甚至超过了15%。
, 百拇医药
掺杂了大量内瓤和种子的石榴皮饮片是否会对其质量产生影响，石榴瓤和种子中化学成分与石榴皮又有何差异呢？针对上述问题，本研究建立了石榴皮饮片HPLC指纹图谱，采用该色谱条件对三者化学成分进行了比较，同时测定了石榴皮主要成分没食子酸和鞣花酸在三者中的含量情况，初步探讨了石榴皮、内瓤和籽化学成分的异同，本研究可为石榴皮饮片的净制提供一定的试验依据。
1 材料
Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996 DAD检测器；R200D 1/10万电子天平(德国Sartorius)；LC-350A超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂)。
没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110831-200302)；鞣花酸对照品(Alfa Aesar，批号10149850)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲醇、磷酸均为分析纯。试验用石榴皮饮片均为市售品，批号(产地)分别为110301(河北)、100401(河北)、100907(河北)、1004253(河北)、20100718(四川)、090401(安徽)、001006832(安徽)、110704(山东)、100603(山东)，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定，为石榴科植物石榴P. granatum 的干燥果皮。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Phenomenex hyperclone C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱，0～20 min，1%A，20～80 min，1%～15%A，80～100 min，15%～30%A，流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 没食子酸对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含对照品3.3 mg的溶液。
2.2.2 鞣花酸对照品溶液的制备 取糅花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含对照品0.16 mg的溶液。
, http://www.100md.com
2.3 供试品溶液的制备
取石榴皮样品粉末(过40目筛)0.25 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称重，超声提取1 h，放凉，再次称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.4 测定方法
分别精密吸取对照品和供试品溶液各2 μL，注入高效液相色谱仪。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取同一份石榴皮(批号110704)供试品溶液2 μL，连续进样5次，以糅花酸峰(9号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
, 百拇医药 2.5.2 稳定性试验 取同一份石榴皮供试品溶液，室温下保存，分别于0，2，4，8，12 h测定，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明指纹图谱稳定性符合要求，样品在12 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性试验 精密称取同一石榴皮饮片粉末6份，以2.3项下方法制备供试品溶液，记录HPLC图谱，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。
2.6 石榴皮饮片指纹图谱测定
取搜集的各批次石榴皮饮片，分别制备供试品溶液，进样。将所得图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件。以批号110301的饮片色谱图作为参照图谱，进行指纹匹配。采用平均数法生成对照图谱。石榴皮饮片HPLC指纹图谱叠加图和对照图谱见图1。9个批次饮片与对照图谱之间的相似度依次为0.952，0.979，0.935，0.994，0.906，0.994，0.930，0.989，0.979。9批石榴皮饮片指纹图谱共有峰(9个)的相对保留时间和相对峰面积统计结果见表1，2。
2.7 石榴皮、石榴瓤和石榴籽的HPLC图谱比较
取同一批石榴皮样品(批号110704)，从该样品中仔细分离石榴皮、瓤和籽，粉碎，过40目筛，各取0.25 g，精密称定，以2.3项下方法制备供试品溶液。依照指纹图谱色谱条件进行测定，色谱图见图2。, 百拇医药(周倩，孙立立，戴衍朋，王亮，苏本正)
[关键词] 石榴皮；石榴瓤；石榴籽；HPLC指纹图谱；没食子酸；鞣花酸
石榴皮始载于《雷公炮炙论》，为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，具有涩肠止泻、止血、驱虫等功效，是临床常用的传统中药之一。石榴皮约占到石榴质量的20%～30%[1]，石榴皮饮片的制备方法，2010年版《中国药典》描述如下“除去杂质，洗净，切块，干燥”[2]。《全国中药炮制规范》中要求“除去杂质，去净残留的内瓤及种子，洗净，切块，干燥，或洗净，干燥后捣碎”[3]。然而在对市场销售的石榴皮饮片调研中发现，市售石榴皮饮片中往往都含有大量石榴瓤和石榴籽，有一些样品中瓤和籽的量甚至超过了15%。
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掺杂了大量内瓤和种子的石榴皮饮片是否会对其质量产生影响，石榴瓤和种子中化学成分与石榴皮又有何差异呢？针对上述问题，本研究建立了石榴皮饮片HPLC指纹图谱，采用该色谱条件对三者化学成分进行了比较，同时测定了石榴皮主要成分没食子酸和鞣花酸在三者中的含量情况，初步探讨了石榴皮、内瓤和籽化学成分的异同，本研究可为石榴皮饮片的净制提供一定的试验依据。
1 材料
Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2996 DAD检测器；R200D 1/10万电子天平(德国Sartorius)；LC-350A超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂)。
没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110831-200302)；鞣花酸对照品(Alfa Aesar，批号10149850)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲醇、磷酸均为分析纯。试验用石榴皮饮片均为市售品，批号(产地)分别为110301(河北)、100401(河北)、100907(河北)、1004253(河北)、20100718(四川)、090401(安徽)、001006832(安徽)、110704(山东)、100603(山东)，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定，为石榴科植物石榴P. granatum 的干燥果皮。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件
Phenomenex hyperclone C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱，0～20 min，1%A，20～80 min，1%～15%A，80～100 min，15%～30%A，流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 没食子酸对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含对照品3.3 mg的溶液。
2.2.2 鞣花酸对照品溶液的制备 取糅花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含对照品0.16 mg的溶液。
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2.3 供试品溶液的制备
取石榴皮样品粉末(过40目筛)0.25 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称重，超声提取1 h，放凉，再次称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.4 测定方法
分别精密吸取对照品和供试品溶液各2 μL，注入高效液相色谱仪。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取同一份石榴皮(批号110704)供试品溶液2 μL，连续进样5次，以糅花酸峰(9号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
, 百拇医药 2.5.2 稳定性试验 取同一份石榴皮供试品溶液，室温下保存，分别于0，2，4，8，12 h测定，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明指纹图谱稳定性符合要求，样品在12 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性试验 精密称取同一石榴皮饮片粉末6份，以2.3项下方法制备供试品溶液，记录HPLC图谱，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。
2.6 石榴皮饮片指纹图谱测定
取搜集的各批次石榴皮饮片，分别制备供试品溶液，进样。将所得图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件。以批号110301的饮片色谱图作为参照图谱，进行指纹匹配。采用平均数法生成对照图谱。石榴皮饮片HPLC指纹图谱叠加图和对照图谱见图1。9个批次饮片与对照图谱之间的相似度依次为0.952，0.979，0.935，0.994，0.906，0.994，0.930，0.989，0.979。9批石榴皮饮片指纹图谱共有峰(9个)的相对保留时间和相对峰面积统计结果见表1，2。
2.7 石榴皮、石榴瓤和石榴籽的HPLC图谱比较
取同一批石榴皮样品(批号110704)，从该样品中仔细分离石榴皮、瓤和籽，粉碎，过40目筛，各取0.25 g，精密称定，以2.3项下方法制备供试品溶液。依照指纹图谱色谱条件进行测定，色谱图见图2。, 百拇医药(周倩，孙立立，戴衍朋，王亮，苏本正)