金线莲与内生真菌共生培养体系的建立
作者：于雪梅 郭顺星
单位：于雪梅(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；郭顺星(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)
关键词：共生体系；金线莲；内生真菌
中国中药杂志000206 摘 要：目的：建立金线莲与内生真菌共生培养体系，为研究内生真菌促进金线莲生长机理及金线莲栽培新方法奠定基础。方法：在金线莲组培苗基础上，将金线莲苗与真菌共培养，定期观察记录金线莲苗与真菌的生长状态，根据菌-苗共生特点筛选适合金线莲与内生真菌共生的培养条件。结果：建立了金线莲与内生真菌的共生培养体系。最适共生培养基为(mg.L-1)：NH4NO3 825，KNO3 950，MgSO4 185，肌醇100，其它有机成分为MS培养基有机成分量的2/3，蔗糖15 g.L-1，其它成分同MS培养基，琼脂9 g.L-1,pH 5.8。培养条件为培养温度24～25 ℃，光照150 lx，光照时间11 h。结论：在此共生培养体系中金线莲苗与所筛选出的优良菌种可形成内生菌根，并可长期共生，且真菌有促进金线莲生长发育作用。
, 百拇医药
Establishment of Symbiotic System for Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. and Endophytic Fungi
YU Xue-mei ， GUO Shun-xing
(Institute of Medicinal Plants CAMS and PUMC,Beijing 100094,China)
Abstract：Objevtive:Setting up a symbiotic system for Anoectochilus roxburghii and endophytic fungi,so as to study the relationship between them and try to set up new cultural methods for A.roxburghii.Method:A.roxburghii and its endophytic fungi were cultured together on five kinds of media in flasks.The growth of the plantlets and fungi were observed.Symbiotic conditions were selected according to symbiotic characteristics.Results:A symbiotic system for A.roxburghii and endophytic fungi was set up.The optimum composition of the system induded NH4NO3 825 mg.L-1, KNO3 950 mg.L-1, MgSO4 185 mg.L-1, and inositol 100 mg.L-1, other organic components being 2/3 times those of MS medium,sugrose 15 g.L-1,and other components being the same as those of MS medium,agar 9 g.L-1,pH 5.8.The culture was effected at 24～25℃ under cool white fluorescent light(150 lx)for a photoperiod of 11 hours.Conclusion:A.roxburghii and endophytic fungi can grow well together and form endomycorrhiza in the symbiotic system.Moreover,endophytic fungi help stimulate the growth and developmemt of A.roxburghii.
, 百拇医药
Key words：symbiotic system;A.roxburghii；endophytic fungi▲
兰科植物中有许多名贵花卉和珍稀药用植物，并且在自然条件下大都与真菌共生。金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl为兰科花叶开唇兰属植物，为名贵中草药，具有清热凉血、祛风利湿、强心、固肾、利尿、平肝、降血压等功效。近年来主要用于治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症，引起医药界的广泛重视。民间称其为“神药”[1]。由于该植物自然生态条件独特，繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，特别是近年来对其需求量猛增，产区人们过度采挖，使得金线莲野生资源日渐枯竭。在野生金线莲的根中，我们已观察到内生真菌的存在。因此，建立金线莲与内生真菌共生培养体系，筛选促进金线莲生长的优良共生菌种，进而研究金线莲与内生真菌的关系，对保护金线莲的种质资源，研究其新的栽培繁殖方法具有较大理论意义和应用价值。
1 实验材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验材料
植物材料为金线莲A.roxburghii无菌苗。真菌为分离自兰科植物的内生真菌，即解剖发现根细胞内存在真菌菌丝。其中94017真菌分离自金线莲，94005真菌分离自铁皮石斛Dendrobium candidum Wall. ex Lindl。
1.2 方法
1.2.1 植物培养：用金线莲茎段、茎尖诱导出芽，将芽转入MS培养基中成苗，1～2个月后，苗高2～ 4 cm，根长0.5～1.5 cm。
1.2.2 菌种培养：将真菌接种到平皿麦麸培养基上培养7～10 d。
1.2.3 供试培养基：A.MS培养基；B.MS培养基，无有机成分；C.MS培养基，无微量元素；D.MS培养基，无蔗糖；E.NH4NO3 825 mg.L-1，KNO3 950 mg.L-1，MgSO4 185 mg.L-1，肌醇100 mg.L-1，其它有机成分为MS培养基有机成分量的2/3，蔗糖15 g.L-1，其它成分同MS培养基，琼脂9 g.L-1，pH 5.8[2～4]。
, 百拇医药
1.2.4 共生培养条件的筛选：将金线莲无菌苗垂直插入5种供试培养基中，每100 ml三角瓶中2株幼苗，两苗相距1～1.5 cm，培养10～15 d时，将经麦麸培养基活化的94017，94005两种真菌分别用打孔器(直径0.45 cm)在菌落表面打取平板菌块，然后用接种针将一平板菌块接种于与两苗相距3 cm培养基上，并稍将菌块按入培养基中。每种培养基均设对照(即只接苗不接种真菌)。每一处理重复3瓶。培养温度24～25 ℃，光照150 lx，光照时间11 h。定期观察记录金线莲苗与真菌的生长状态。
1.2.5 接菌后金线莲组织学观察：将苗从瓶中取出，洗去培养基，切取根段3～5 cm固定于FAA液中。常规石蜡包埋与切片，片厚15 μm，番红固绿染色，光学显微镜观察。
2 结果和分析
2.1 不同培养基上菌-苗生长状态
, http://www.100md.com 在5种培养基上，94017真菌生长速度都较94005真菌快，这是由真菌自身特性决定的。在MS培养基上，两种真菌生长较快，94017菌接种10d即侵染到植株下部茎1 cm处。94005菌接种15～20 d与苗相接触。培养25～30 d时，接种94017菌的苗基部出出褐色分泌物，接种94005菌的苗有的下部变黑。培养60 d时未接种真菌苗平均增高显著高于接种真菌的苗增高。在B，C培养基上，94017菌与苗共培养25～30 d时菌才基本与苗相接触，继续培养时，两种菌的生长速度减慢，培养60 d时，94005菌还未与金线莲的根完全接触，根仍然呈绿色。在D培养基上，两种真菌几乎不能生长，苗后期变成黄褐色。金线莲苗细弱，且生长速度缓慢。在E培养基上，培养25～30 d时，两种菌与苗相接触，培养60 d时，两种菌都已与金线莲的根完全接触，即菌丝包围在根周围，根呈浅黄褐色。在整个培养过程中，植株长势健壮。继续将两者共培养6个月，两者仍保持共生状态。
2.2 不同培养基上真菌对金线莲的影响(表1)
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表1 培养60 d时不同培养基上2种真菌对金线莲生长的影响 cm 培养基
未接菌苗
增高
接94017菌苗
增高
接94005菌苗
增高
A
1.958
1.150
1.083
B
, 百拇医药
3.550
2.100
1.600
C
1.817
1.442
1.708
D
1.600
0.900
0.475
E
1.883
, 百拇医药
2.550
2.100
注：n=3
由表1可见，A，B，C，D 4种培养基上接种真菌的苗增高均低于未接种真菌的苗增高。E培养基上接种94017真的苗增高为2.1 cm，高于未接种真菌的苗增高(1.883 cm)。
在5种培养基上，接种真菌的金线莲苗增高最高为E，高于其它4种培养基。未接种真菌的金线莲苗培养60 d时B增高最高(3.55 cm)，其余依次为A(1.958 cm)，E(1.883 cm)，C(1.817 cm)，D(1.600 cm)。
2.3 接菌后金线莲组织学观察
在菌-苗共培养的前期约25～30 d时，94017菌对在MS和B培养基上的金线莲根几乎侵染至全部皮层细胞，而94005菌仅侵染根的部分表皮细胞。但在E培养基上菌苗培养的后期60 d时94017，94005两菌均以菌丝结形式定殖于金线莲根表皮细胞及少数在皮层最外一层细胞内，表皮细胞分布有大量的菌丝，并可见菌丝碎段。表皮细胞壁及皮层最外一层细胞壁明显加厚，被番红染成红色，皮层最外一层细胞除被菌丝定殖的细胞外，其余多中空，无细胞质及细胞核。皮层及维管组织部分细胞的核明显膨大。接种94005菌的金线莲根在真菌未侵入时，维管组织周围的皮层细胞内有多糖颗粒累积在核周围，真菌侵入后多糖颗粒减少，变为脂肪类物质累积在核周围。接种94017菌的根细胞内多糖颗粒在菌丝侵入前后均较接种94005菌的多。
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3 讨论与小结
3.1 共生培养基的筛选，在不同培养基上，金线莲苗与真菌生长状态不同。真菌对金线莲苗生长的影响也不同。在全营养的MS培养基中菌过于旺盛生长，与苗竞争营养成分和空间，并将植物的根全部侵染，影响了苗的生长。在缺乏一类营养物质的B，C培养基上，94005菌一直未侵染至根内，根呈绿色。通常兰科植物菌根呈浅黄褐色、浅黄色或乳白色。说明菌与植物根未形成菌根，菌与植物未建立共生关系，二者仍是竞争关系。从表1可看出在B，C培养基上接种真菌均不利于植株生长。在D培养基上菌-苗均不能很好生长。说明蔗糖作为碳源是菌与苗生长必不可少的条件。E培养基上菌-苗都能很好生长，且真菌促进苗生长，二者可长期共存。真菌以菌丝结形式定殖于根表皮细胞及少数皮层最外一层细胞内，植株根浅黄褐色，为兰科植物菌根特征，说明两种菌均与植物建立了共生关系，形成了菌根。另外，一般认为内生真菌不但可促进植物生长，同时还可防止植物致病菌对其污染，因为这些真菌常可产生抗生素类物质，为植物生长创造一个良好微环境[5]。
, http://www.100md.com
虽然A，B培养基上未接菌的苗增高高于E培养基上接菌苗增高，因本实验主要目的是筛选适合菌-苗共生的最佳培养基，而A，B培养基并不适合菌-苗建立共生关系。综合上述现象，初选E培养基为共生培养基。
3.2 A，B，C，D培养基上接种真菌对苗影响较大，可能由于A培养基糖浓度过高，造成真菌严重侵染植株。B，D培养基缺乏有机成分和蔗糖两大重要成分，加之菌竞争营养，对植株生长有较大影响。E培养基适合菌苗共生，二者在其上可交换营养物质，因此菌促进苗生长。C培养基上接菌与不接菌对苗影响不如A，B，D，E培养基明显，可能微量元素不是菌-苗共培养时的主要制约因素。
3.4 本实验筛选出的共生培养体系验证了Hadley(1974),Dijk(1995)[2],Beyrie(1995)[3]等实验结果，即糖浓度低时有利于兰科植物与内生真菌共生，低氮情况下内生真菌促进兰科植物生长。这也是本实验E培养基的设计依据。现已将其应用于研究金线莲与内生真菌的关系中。虽然本实验筛选出的共生培养体系适合兰科植物与内生真菌共生，并保持二者的共生平衡关系，但是，兰科植物菌根中真菌同寄主之间共生平衡关系也是有条件的，一旦环境条件改变，也可能导致这种平衡关系发生变化[5]。另外，共生培养体的优化还需要进一步探索。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970018)
参考文献：
[1]钟岑生.金线莲的药用价值与开发.广西农业科学，1997，(2)：102.
[2]Dijk E,Eck N D.Effects of Mycorrhizal Fungi on in Vitro Nitrogen Response of Some Dutch Indigenous Orchis Species.Can J Bot,1995,73:1203.
[3]Beyrie H F,Smith S E,Peterson R L,et al.Colonization of Orchis morio Protocorms by a Mycorrhizal Fungus:Effects of Nitrogen Nutrition and Glyphosate of Nitrogen Nutrition and Glyphosate in Modifying the Responses.Can J Bot,1995,73:1128.
[4]郭顺星，徐锦堂.促进天麻等兰科植物种子萌发的真菌发酵液的抑菌作用.中国药学杂志，1990，25(4)：200.
[5]郭秀珍，毕国昌.林木菌根及应用技术.北京：中国林业出版社，1998：140.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药
单位：于雪梅(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)；郭顺星(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)
关键词：共生体系；金线莲；内生真菌
中国中药杂志000206 摘 要：目的：建立金线莲与内生真菌共生培养体系，为研究内生真菌促进金线莲生长机理及金线莲栽培新方法奠定基础。方法：在金线莲组培苗基础上，将金线莲苗与真菌共培养，定期观察记录金线莲苗与真菌的生长状态，根据菌-苗共生特点筛选适合金线莲与内生真菌共生的培养条件。结果：建立了金线莲与内生真菌的共生培养体系。最适共生培养基为(mg.L-1)：NH4NO3 825，KNO3 950，MgSO4 185，肌醇100，其它有机成分为MS培养基有机成分量的2/3，蔗糖15 g.L-1，其它成分同MS培养基，琼脂9 g.L-1,pH 5.8。培养条件为培养温度24～25 ℃，光照150 lx，光照时间11 h。结论：在此共生培养体系中金线莲苗与所筛选出的优良菌种可形成内生菌根，并可长期共生，且真菌有促进金线莲生长发育作用。
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Establishment of Symbiotic System for Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. and Endophytic Fungi
YU Xue-mei ， GUO Shun-xing
(Institute of Medicinal Plants CAMS and PUMC,Beijing 100094,China)
Abstract：Objevtive:Setting up a symbiotic system for Anoectochilus roxburghii and endophytic fungi,so as to study the relationship between them and try to set up new cultural methods for A.roxburghii.Method:A.roxburghii and its endophytic fungi were cultured together on five kinds of media in flasks.The growth of the plantlets and fungi were observed.Symbiotic conditions were selected according to symbiotic characteristics.Results:A symbiotic system for A.roxburghii and endophytic fungi was set up.The optimum composition of the system induded NH4NO3 825 mg.L-1, KNO3 950 mg.L-1, MgSO4 185 mg.L-1, and inositol 100 mg.L-1, other organic components being 2/3 times those of MS medium,sugrose 15 g.L-1,and other components being the same as those of MS medium,agar 9 g.L-1,pH 5.8.The culture was effected at 24～25℃ under cool white fluorescent light(150 lx)for a photoperiod of 11 hours.Conclusion:A.roxburghii and endophytic fungi can grow well together and form endomycorrhiza in the symbiotic system.Moreover,endophytic fungi help stimulate the growth and developmemt of A.roxburghii.
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Key words：symbiotic system;A.roxburghii；endophytic fungi▲
兰科植物中有许多名贵花卉和珍稀药用植物，并且在自然条件下大都与真菌共生。金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl为兰科花叶开唇兰属植物，为名贵中草药，具有清热凉血、祛风利湿、强心、固肾、利尿、平肝、降血压等功效。近年来主要用于治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症，引起医药界的广泛重视。民间称其为“神药”[1]。由于该植物自然生态条件独特，繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，特别是近年来对其需求量猛增，产区人们过度采挖，使得金线莲野生资源日渐枯竭。在野生金线莲的根中，我们已观察到内生真菌的存在。因此，建立金线莲与内生真菌共生培养体系，筛选促进金线莲生长的优良共生菌种，进而研究金线莲与内生真菌的关系，对保护金线莲的种质资源，研究其新的栽培繁殖方法具有较大理论意义和应用价值。
1 实验材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验材料
植物材料为金线莲A.roxburghii无菌苗。真菌为分离自兰科植物的内生真菌，即解剖发现根细胞内存在真菌菌丝。其中94017真菌分离自金线莲，94005真菌分离自铁皮石斛Dendrobium candidum Wall. ex Lindl。
1.2 方法
1.2.1 植物培养：用金线莲茎段、茎尖诱导出芽，将芽转入MS培养基中成苗，1～2个月后，苗高2～ 4 cm，根长0.5～1.5 cm。
1.2.2 菌种培养：将真菌接种到平皿麦麸培养基上培养7～10 d。
1.2.3 供试培养基：A.MS培养基；B.MS培养基，无有机成分；C.MS培养基，无微量元素；D.MS培养基，无蔗糖；E.NH4NO3 825 mg.L-1，KNO3 950 mg.L-1，MgSO4 185 mg.L-1，肌醇100 mg.L-1，其它有机成分为MS培养基有机成分量的2/3，蔗糖15 g.L-1，其它成分同MS培养基，琼脂9 g.L-1，pH 5.8[2～4]。
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1.2.4 共生培养条件的筛选：将金线莲无菌苗垂直插入5种供试培养基中，每100 ml三角瓶中2株幼苗，两苗相距1～1.5 cm，培养10～15 d时，将经麦麸培养基活化的94017，94005两种真菌分别用打孔器(直径0.45 cm)在菌落表面打取平板菌块，然后用接种针将一平板菌块接种于与两苗相距3 cm培养基上，并稍将菌块按入培养基中。每种培养基均设对照(即只接苗不接种真菌)。每一处理重复3瓶。培养温度24～25 ℃，光照150 lx，光照时间11 h。定期观察记录金线莲苗与真菌的生长状态。
1.2.5 接菌后金线莲组织学观察：将苗从瓶中取出，洗去培养基，切取根段3～5 cm固定于FAA液中。常规石蜡包埋与切片，片厚15 μm，番红固绿染色，光学显微镜观察。
2 结果和分析
2.1 不同培养基上菌-苗生长状态
, http://www.100md.com 在5种培养基上，94017真菌生长速度都较94005真菌快，这是由真菌自身特性决定的。在MS培养基上，两种真菌生长较快，94017菌接种10d即侵染到植株下部茎1 cm处。94005菌接种15～20 d与苗相接触。培养25～30 d时，接种94017菌的苗基部出出褐色分泌物，接种94005菌的苗有的下部变黑。培养60 d时未接种真菌苗平均增高显著高于接种真菌的苗增高。在B，C培养基上，94017菌与苗共培养25～30 d时菌才基本与苗相接触，继续培养时，两种菌的生长速度减慢，培养60 d时，94005菌还未与金线莲的根完全接触，根仍然呈绿色。在D培养基上，两种真菌几乎不能生长，苗后期变成黄褐色。金线莲苗细弱，且生长速度缓慢。在E培养基上，培养25～30 d时，两种菌与苗相接触，培养60 d时，两种菌都已与金线莲的根完全接触，即菌丝包围在根周围，根呈浅黄褐色。在整个培养过程中，植株长势健壮。继续将两者共培养6个月，两者仍保持共生状态。
2.2 不同培养基上真菌对金线莲的影响(表1)
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表1 培养60 d时不同培养基上2种真菌对金线莲生长的影响 cm 培养基
未接菌苗
增高
接94017菌苗
增高
接94005菌苗
增高
A
1.958
1.150
1.083
B
, 百拇医药
3.550
2.100
1.600
C
1.817
1.442
1.708
D
1.600
0.900
0.475
E
1.883
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2.550
2.100
注：n=3
由表1可见，A，B，C，D 4种培养基上接种真菌的苗增高均低于未接种真菌的苗增高。E培养基上接种94017真的苗增高为2.1 cm，高于未接种真菌的苗增高(1.883 cm)。
在5种培养基上，接种真菌的金线莲苗增高最高为E，高于其它4种培养基。未接种真菌的金线莲苗培养60 d时B增高最高(3.55 cm)，其余依次为A(1.958 cm)，E(1.883 cm)，C(1.817 cm)，D(1.600 cm)。
2.3 接菌后金线莲组织学观察
在菌-苗共培养的前期约25～30 d时，94017菌对在MS和B培养基上的金线莲根几乎侵染至全部皮层细胞，而94005菌仅侵染根的部分表皮细胞。但在E培养基上菌苗培养的后期60 d时94017，94005两菌均以菌丝结形式定殖于金线莲根表皮细胞及少数在皮层最外一层细胞内，表皮细胞分布有大量的菌丝，并可见菌丝碎段。表皮细胞壁及皮层最外一层细胞壁明显加厚，被番红染成红色，皮层最外一层细胞除被菌丝定殖的细胞外，其余多中空，无细胞质及细胞核。皮层及维管组织部分细胞的核明显膨大。接种94005菌的金线莲根在真菌未侵入时，维管组织周围的皮层细胞内有多糖颗粒累积在核周围，真菌侵入后多糖颗粒减少，变为脂肪类物质累积在核周围。接种94017菌的根细胞内多糖颗粒在菌丝侵入前后均较接种94005菌的多。
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3 讨论与小结
3.1 共生培养基的筛选，在不同培养基上，金线莲苗与真菌生长状态不同。真菌对金线莲苗生长的影响也不同。在全营养的MS培养基中菌过于旺盛生长，与苗竞争营养成分和空间，并将植物的根全部侵染，影响了苗的生长。在缺乏一类营养物质的B，C培养基上，94005菌一直未侵染至根内，根呈绿色。通常兰科植物菌根呈浅黄褐色、浅黄色或乳白色。说明菌与植物根未形成菌根，菌与植物未建立共生关系，二者仍是竞争关系。从表1可看出在B，C培养基上接种真菌均不利于植株生长。在D培养基上菌-苗均不能很好生长。说明蔗糖作为碳源是菌与苗生长必不可少的条件。E培养基上菌-苗都能很好生长，且真菌促进苗生长，二者可长期共存。真菌以菌丝结形式定殖于根表皮细胞及少数皮层最外一层细胞内，植株根浅黄褐色，为兰科植物菌根特征，说明两种菌均与植物建立了共生关系，形成了菌根。另外，一般认为内生真菌不但可促进植物生长，同时还可防止植物致病菌对其污染，因为这些真菌常可产生抗生素类物质，为植物生长创造一个良好微环境[5]。
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虽然A，B培养基上未接菌的苗增高高于E培养基上接菌苗增高，因本实验主要目的是筛选适合菌-苗共生的最佳培养基，而A，B培养基并不适合菌-苗建立共生关系。综合上述现象，初选E培养基为共生培养基。
3.2 A，B，C，D培养基上接种真菌对苗影响较大，可能由于A培养基糖浓度过高，造成真菌严重侵染植株。B，D培养基缺乏有机成分和蔗糖两大重要成分，加之菌竞争营养，对植株生长有较大影响。E培养基适合菌苗共生，二者在其上可交换营养物质，因此菌促进苗生长。C培养基上接菌与不接菌对苗影响不如A，B，D，E培养基明显，可能微量元素不是菌-苗共培养时的主要制约因素。
3.4 本实验筛选出的共生培养体系验证了Hadley(1974),Dijk(1995)[2],Beyrie(1995)[3]等实验结果，即糖浓度低时有利于兰科植物与内生真菌共生，低氮情况下内生真菌促进兰科植物生长。这也是本实验E培养基的设计依据。现已将其应用于研究金线莲与内生真菌的关系中。虽然本实验筛选出的共生培养体系适合兰科植物与内生真菌共生，并保持二者的共生平衡关系，但是，兰科植物菌根中真菌同寄主之间共生平衡关系也是有条件的，一旦环境条件改变，也可能导致这种平衡关系发生变化[5]。另外，共生培养体的优化还需要进一步探索。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970018)
参考文献：
[1]钟岑生.金线莲的药用价值与开发.广西农业科学，1997，(2)：102.
[2]Dijk E,Eck N D.Effects of Mycorrhizal Fungi on in Vitro Nitrogen Response of Some Dutch Indigenous Orchis Species.Can J Bot,1995,73:1203.
[3]Beyrie H F,Smith S E,Peterson R L,et al.Colonization of Orchis morio Protocorms by a Mycorrhizal Fungus:Effects of Nitrogen Nutrition and Glyphosate of Nitrogen Nutrition and Glyphosate in Modifying the Responses.Can J Bot,1995,73:1128.
[4]郭顺星，徐锦堂.促进天麻等兰科植物种子萌发的真菌发酵液的抑菌作用.中国药学杂志，1990，25(4)：200.
[5]郭秀珍，毕国昌.林木菌根及应用技术.北京：中国林业出版社，1998：140.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药